基于噬菌體模擬表位的有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留免疫檢測(cè)方法的研究.pdf

1、有機(jī)磷農(nóng)藥是一類具有廣譜殺蟲特性和較低穩(wěn)定性的農(nóng)藥，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。但是，有機(jī)磷農(nóng)藥會(huì)抑制膽堿酯酶的活性，過度或不合理的使用會(huì)對(duì)人類健康構(gòu)成威脅，因此，建立一種快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的檢測(cè)環(huán)境和食物中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的分析方法是十分必要的。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）具有檢測(cè)成本低、檢測(cè)速度快并且可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品的優(yōu)勢(shì)，被廣泛地應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期制備的有機(jī)磷農(nóng)藥寬譜單克隆抗體3A7具有較好的寬譜特

2、異性，但是仍存在靈敏度不足的問題。為了進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度，本研究采用噬菌體展示技術(shù)篩選有機(jī)磷農(nóng)藥的抗原模擬表位，并建立了更加靈敏的基于噬菌體模擬表位的免疫分析方法。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）本研究以有機(jī)磷農(nóng)藥寬譜特異性單克隆抗體3A7為靶標(biāo)，同時(shí)使用噬菌體隨機(jī)展示線性七肽庫、線性十二肽庫和環(huán)七肽庫混合肽庫，經(jīng)過四輪生物淘選成功地將噬菌體進(jìn)行了富集，回收率從1.2×10-7提高到了1.1×10-2。挑取179個(gè)噬菌體單克隆用

3、于間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，在250ng/mL對(duì)硫磷存在下，有競(jìng)爭(zhēng)作用的有91個(gè)，挑取效果較好的14個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，篩選到了5種有機(jī)磷農(nóng)藥模擬表位，包括1種線性七肽模擬表位和4種線性十二肽模擬表位。
　　（2）為了使建立的P-ELISA具有更高的靈敏度，以Amax/IC50的比值為標(biāo)準(zhǔn)選擇了噬菌體肽21為最佳的噬菌體抗原。通過對(duì)甲醇濃度、脫脂奶粉濃度、pH和離子強(qiáng)度的優(yōu)化，確定了噬菌體肽21使用的最優(yōu)條件為pH6.5

4、，5×PBS，2.5％甲醇和0.4%脫脂奶粉。
　　（3）在最優(yōu)檢測(cè)條件下，建立的P-ELISA對(duì)多種有機(jī)磷農(nóng)藥具有交叉反應(yīng)，尤其是對(duì)8種O,O-二乙基類和6種O,O-二甲基類有機(jī)磷農(nóng)藥具有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，對(duì)這14種農(nóng)藥的IC50值在5.24-63.25ng/mL之間，平均IC50值為37.04ng/mL，變異系數(shù)為42.98%。與化學(xué)合成包被原建立的異源 ELISA相比，P-ELISA對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏度都有所提高，對(duì)倍硫磷的靈

5、敏度提高了3倍以上，除對(duì)甲基毒死蜱和乙基嘧啶磷的靈敏度提高2倍外，對(duì)其余17種有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏度均提高了1倍左右。
　　（4）樣品的添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)硫磷、倍硫磷、二嗪農(nóng)和殺螟硫磷在黃瓜、生菜、蘋果和西瓜樣品中的添加回收率在82.03-103.63%之間，變異系數(shù)在2.31-13.80%之間，說明建立的 P-ELISA檢測(cè)方法適用于蔬菜和水果等樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)。
　　總之，噬菌體具有無毒、易擴(kuò)增、靈敏度高和使