盾葉薯蕷花藥培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng).pdf

1、盾葉薯蕷（Dioseorea zingiberensis C.H.Wright）是我國特有的野生藥源植物，其薯蕷皂甙元含量居世界首位，人工栽培后薯蕷皂甙元含量和產(chǎn)量普遍下降，生物技術(shù)結(jié)合常規(guī)育種手段是解決這一問題的有效途徑。本研究利用花藥培養(yǎng)技術(shù)獲得再生植株；以種子胚為外植體建立胚性懸浮細(xì)胞系，進(jìn)行原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)；以期為盾葉薯蕷的高含和高產(chǎn)育種提供一個(gè)新途徑。本課題對(duì)影響花藥培養(yǎng)和植株再生的幾個(gè)關(guān)鍵因素、影響胚性愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基

2、成分、原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的優(yōu)化條件等問題進(jìn)行了研究與探討。 主要結(jié)果如下： 一、以盾葉薯蕷花藥為試材，就基因型、基本培養(yǎng)基、激素種類和濃度、分化培養(yǎng)基等對(duì)花藥培養(yǎng)和植株再生的影響進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，獲得了盾葉薯蕷花藥培養(yǎng)再生植株。 （1）基本培養(yǎng)基的篩選 取單核靠邊期的花藥，分別接種在W14、B5、MS、N6等基本培養(yǎng)基中，統(tǒng)計(jì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果顯示：4種基本培養(yǎng)基的花藥愈傷組織平均誘導(dǎo)率分別為2.15

3、％、0.50％、0.18％、0.10％，說明W14是適合盾葉薯蕷花藥愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基。 （2）基因型的差異 在W14＋2,4-D2.0mg/L＋KT2.0mg/L＋NAA 0.5mg/L＋60g/L麥芽糖的培養(yǎng)基上，4種基因型的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率存在差異，河南南陽的材料誘導(dǎo)率最高達(dá)到5.20％，湖北武當(dāng)山的材料誘導(dǎo)率只有0.80％。 （3）2,4-D和KT對(duì)花藥誘導(dǎo)的影響湖北武當(dāng)?shù)幕ㄋ幱鷤M織誘導(dǎo)率隨2,4－D

4、濃度的升高而增大，當(dāng)2,4-D濃度為2mg／L時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)到最高；誘導(dǎo)率隨著KT濃度的升高而降低，不添加KT時(shí)誘導(dǎo)率最高；因此盾葉薯蕷花藥愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)不需要添加KT，適宜的激素為2,4-D 2mg/L。但不同基因型對(duì)這2種激素的反應(yīng)有明顯差異。 （4）分化培養(yǎng) 先將花藥愈傷轉(zhuǎn)入芽分化培養(yǎng)基，待分化出芽后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基。芽分化基本培養(yǎng)基為MS，適宜的激素組合為BA2.0 mg/L＋I(xiàn)AA0.2mg/L。篩選的生根培養(yǎng)基為1

5、/2MS＋I(xiàn)BA2.0 mg/L＋NAA0.4mg/L＋活性碳0.5mg/L。 （5）再生植株的倍性鑒定：對(duì)33個(gè)花藥愈傷組織或再生植株的流式細(xì)胞儀檢測，有4株為單倍體；對(duì)24個(gè)花培植株根尖的染色體計(jì)數(shù)，有2株為單倍體?；ㄋ幣囵B(yǎng)再生植株的單倍體比例為8.00％-12.00％。 二、 盾葉薯蕷胚性愈傷組織誘導(dǎo)與原生質(zhì)體分離 （1）愈傷組織誘導(dǎo)：以種子胚為外植體，在MS基本培養(yǎng)基上添加2,4-D 1.0mg/L+BA

6、 0.2mg/L，3種基因型之間愈傷組織誘導(dǎo)率存在明顯差異，其誘導(dǎo)率分別為100.00％、53.54％、43.86％。3種基因型種子胚誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基：“03-442號(hào)"為MS+2,4-D 1.0mg/L+BA 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L；“03-415號(hào)”為MS+2,4-D 1.0m/L+BA0．2mg/L+NAA 1.0mg/L；“504號(hào)”為MS+2,4-D 1.0mg/L+BA0.2mg/L。 （2）愈傷組織

7、狀態(tài)改良：以“504號(hào)”愈傷為材料，篩選出適宜的增殖繼代培養(yǎng)基：MS+KT0.2mg/L+2,4-D 1.0mg/L+硫酸銨495mg/L，培養(yǎng)基中增大硫酸銨濃度可減緩愈傷組織生長速度，使其呈顏色鮮黃、結(jié)構(gòu)松散的顆粒狀，繼代周期為30-40d，此外誘導(dǎo)時(shí)培養(yǎng)基中添加適量的NAA或以KT0.2mg/L+NAA 1.0mg/L替BA0.2mg/L也可改善愈傷組織的狀態(tài)。 （3）原生質(zhì)體分離：在靜置和60r/min振蕩2種條件下對(duì)，以

8、葉片、微塊莖、愈傷組織、懸浮細(xì)胞為試材分離原生質(zhì)體，結(jié)果顯示靜置酶解時(shí)，懸浮細(xì)胞分離獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高、活力最強(qiáng)，分別為4.1-4.5×10<'7>mg/L、91.00％-93.00％，用微塊莖分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量最低、活力也不高，只有2.0-2.5×10<'7>m/L、82.00％-87.00％；振蕩酶解可以使原生質(zhì)體分離的產(chǎn)量提高5.00％-10.00％，活力提高5.00-12.00％。因此，盾葉薯蕷原生質(zhì)體分離的適宜材料為懸浮細(xì)

9、胞，振蕩酶解有助于提高原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力。 （4）原生質(zhì)體培養(yǎng)：以上述4種外植體分離得到的原生質(zhì)體為試材，在KM8P+2,4-D1.0mg／L+BA0.2mg／L＋葡萄糖（濃度依材料而定）的培養(yǎng)基液體淺層培養(yǎng)，結(jié)果顯示：葉片和微塊莖來源的原生質(zhì)體沒有分裂能力，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長原生質(zhì)體破裂并逐漸解體；愈傷組織和懸浮細(xì)胞來源的原生質(zhì)體培養(yǎng)12h時(shí)有細(xì)胞壁產(chǎn)生，36-60h開始第一次有絲分裂，培養(yǎng)3-4d后觀察到第二次分裂，部分原生