腎康注射液拮抗馬兜鈴酸對人近端腎小管上皮細(xì)胞的作用.pdf

1、研究目的： 含馬兜鈴酸(aristolochic acid，AA)成分的中草藥能夠?qū)е侣择R兜鈴酸腎病(chronic aristolochic acid nephropathy，CAAN)，病理特點(diǎn)為進(jìn)行性寡細(xì)胞性腎間質(zhì)纖維化。CAAN近年來受到廣泛關(guān)注。但是，CAAN的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，更缺良好治療方法。腎康注射液(shen kang injection，SKI)是一種治療慢性腎衰竭的復(fù)方中藥注射液，它含有丹參、紅花、大

2、黃及黃芪等成分。既往實(shí)驗(yàn)研究表明，SKI能改善腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，改善腎功能，延緩慢性腎臟病的進(jìn)展。本研究目的在于探討SKI能否拮抗AA的促間質(zhì)纖維化作用。 方法： 分別用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法和乳酸脫氫酶(LDH)釋放實(shí)驗(yàn)檢測馬兜鈴酸鈉鹽(AA-Na)和(或)SKI對人近端腎小管上皮細(xì)胞(HKC)的增殖及毒性作用。用RT-PCR法檢測(孵育細(xì)胞12h檢測)HKC中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transformin

3、g growth factor-β1，TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、金屬蛋白酶組織抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)以及纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)的mRNA水平，ELISA法檢測(孵育細(xì)胞24h檢測)細(xì)胞上清

4、TGF-βl、TIMP-l、PAl-l蛋白水平，免疫印跡法(Westernblotting)檢測(孵育細(xì)胞36h檢測)細(xì)胞CTGF蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 通過MTT和LDH實(shí)驗(yàn)證明，10 mg／LAA-Na或(和)8 mg／ml SKI既不影響HKC增殖也無細(xì)胞毒性，故用于本實(shí)驗(yàn)研究。RT-PCR檢測顯示，10 mg／LAA-Na能顯著上調(diào)HKC中TGF-βl、CTGF、TIMP-1、PAl-l的mRNA表達(dá)，分別增達(dá)1.8

5、4，1.58，1.62，1.29倍(P<0.05)；加入8mg／ml SKI后，上述TGF-βl、CTGF、TIMP-1及PAI-1 mRNA的高表達(dá)均被顯著抑制，抑制率分別為41.6％，43.7％，43.8％及24.4％(P<0.05)；而SKI對上述因子mRNA表達(dá)無作用(P>0.05)。ELISA檢測顯示，AA-Na 10mg／L能顯著上調(diào)HKC上清中TGF-βl、TIMP-1及PAI-1的蛋白質(zhì)表達(dá)，分別增達(dá)1.12，1.63，

6、1.42倍(P<0.05)；加入8mg／ml SKI后，上述TGF-β1、TIMP-1及PAl-1的蛋白質(zhì)高表達(dá)均被顯著抑制，抑制率分別為34.3％，43.3％及31.1％(P<0.05)；而SKI對上述因子蛋白質(zhì)表達(dá)無作用(P>0.05)。Westernblotting檢測顯示，AA-Na 10mg／L能顯著上調(diào)HKC細(xì)胞層的CTGF蛋白質(zhì)表達(dá)，增達(dá)1：29倍(P<0.05)；加入8mg／ml SKI后，CTGF的蛋白質(zhì)高表達(dá)被顯著抑