煙草NtLTP4基因的克隆及功能分析.pdf

1、煙草產(chǎn)業(yè)是我國(guó)財(cái)政稅收收入的重要來(lái)源。但是，干旱、鹽堿、病蟲(chóng)害等逆境脅迫嚴(yán)重影響了煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)，從而制約了煙草的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。如何提高煙草的生物及非生物脅迫抗性已成為當(dāng)今研究的重要課題。為了應(yīng)對(duì)這種逆境脅迫，植物本身形成了一套精密而復(fù)雜的防御機(jī)制。其中各種脅迫相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控在植物應(yīng)答環(huán)境信號(hào)刺激反應(yīng)過(guò)程中起著重要的作用。非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白(non-specific lipid transfer protein, nsLTPs)在植物

2、抗逆過(guò)程中就起到非常重要的作用。本研究以普通煙（Nicotiana tabacum, NC89）為材料，克隆得到NtLTP4基因，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)功能分析，具體研究結(jié)果如下：
　?。?）基因序列分析表明，該基因cDNA全長(zhǎng)為354bp，編碼117個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測(cè)分子量大約為9kD，其中含有保守的五肽結(jié)構(gòu)域：T/S-X-X-D-R/K和P-Y-X-I-S，且有8個(gè)位置保守的半胱氨酸。NtLTP4具有nsLTP蛋白典型的三級(jí)結(jié)構(gòu)，

3、即4個(gè)α-螺旋，4對(duì)二硫鍵，1個(gè)可結(jié)合和容納脂質(zhì)分子的疏水腔，對(duì)結(jié)合脂質(zhì)分子具有重要的作用。聚類(lèi)分析表明，煙草NtLTP4與煙樹(shù)NgLTP1，擬南芥AtLTP7及AtLTP5等同源性較高，而這些基因均屬于LTP家族中的TypeI類(lèi)。以上結(jié)果表明，NtLTP4屬于LTP家族中的TypeI類(lèi)。
　?。?）構(gòu)建35S-NtLTP4::GFP融和表達(dá)載體，瞬時(shí)侵染本生煙葉片，利用激光共聚焦顯微鏡觀察 GFP熒光，發(fā)現(xiàn)35s-GFP在細(xì)胞質(zhì)

4、和細(xì)胞核中均有熒光，但是35s-NtLTP4::GFP只在細(xì)胞壁周?chē)袩晒?，說(shuō)明NtLTP4可能定位在細(xì)胞壁，為NtLTP4的功能研究提供了理論依據(jù)。
　?。?）采用qRT-PCR的方法，對(duì)NtLTP4基因在煙草受到不同脅迫時(shí)的表達(dá)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，NtLTP4存在組織特異性，且轉(zhuǎn)錄受機(jī)械損傷、高鹽和聚乙二醇（PEG）等非生物脅迫誘導(dǎo)；青枯病菌和馬鈴薯Y病毒等生物脅迫也不同程度的誘導(dǎo)該基因的表達(dá)；激素信號(hào)分子MeJA、AB

5、A和SA可強(qiáng)烈誘導(dǎo)NtLTP4基因的表達(dá)。以上結(jié)果表明NtLTP4可能參與不同的信號(hào)途徑，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　?。?）為研究NtLTP4的功能，構(gòu)建NtLTP4與正義植物表達(dá)載體pROKII的重組載體pROKII-NtLTP4，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化普通煙。通過(guò)擴(kuò)增部分表達(dá)載體序列鑒定陽(yáng)性植株。對(duì)部分轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行qRT-PCR分析，選取NtLTP4表達(dá)水平高、中、低的3個(gè)株系用于功能分析實(shí)驗(yàn)。
　

6、?。?）鹽脅迫處理后，與野生型普通煙相比，轉(zhuǎn)基因植株提高了對(duì)鹽脅迫的抗性。在含不同濃度NaCl（50mM、100mM和200mM）的MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因煙草種子比野生型種子的萌發(fā)率要高；轉(zhuǎn)基因煙草幼苗比野生型煙草幼苗的根長(zhǎng)較長(zhǎng)，生長(zhǎng)勢(shì)好。鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株中丙二醛含量較野生型低43％左右，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度較低，植物細(xì)胞受損害程度較輕；鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株中 ROS產(chǎn)生相關(guān)的基因的表達(dá)量降低，ROS清除相關(guān)基因的

7、表達(dá)量增加，各種抗氧化酶的活性升高， H2O2和O2-含量較野生型分別低29%和18%左右，表明NtLTP4基因通過(guò)提高ROS清除相關(guān)基因，提高抗氧化酶活性，從而降低了植株中的 ROS含量。以上結(jié)果表明，超表達(dá)NtLTP4通過(guò)提高抗氧化能力進(jìn)而增加了鹽脅迫抗性。
　?。?）干旱脅迫處理后，超表達(dá)NtLTP4的轉(zhuǎn)基因植株提高了對(duì)干旱脅迫的抗性。在含不同濃度的甘露醇MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因煙草比野生型幼苗長(zhǎng)勢(shì)更好；H2O2和O2-含量較野

8、生型分別低25%和21%；且與ROS相關(guān)的基因的表達(dá)量均有所改變，各種抗氧化酶的活性也有所升高。以上結(jié)果表明，超表達(dá)NtLTP4可能正調(diào)控干旱脅迫抗性。
　?。?）超表達(dá)NtLTP4的轉(zhuǎn)基因植株提高了對(duì)青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的抗性。與野生型植株相比，青枯菌處理后轉(zhuǎn)基因植株中與 SA信號(hào)途徑相關(guān)的 PR基因（PR1a、PR5）和與MeJA相關(guān)的PR基因（PR4）的表達(dá)量有所增加，推測(cè)NtLTP4可能

9、通過(guò)SA-和JA-介導(dǎo)的信號(hào)途徑的綜合作用提高了對(duì)青枯菌的抗性。
　?。?）超表達(dá) NtLTP4的轉(zhuǎn)基因植株提高了對(duì)病毒的抗性。馬鈴薯 Y病毒普通株系（Potato virus Y Ordinary strain, PVY-O）處理后轉(zhuǎn)基因植株中PR基因（PR1a、PR5）的表達(dá)量增加，推測(cè)NtLTP4可能通過(guò)SA-介導(dǎo)的信號(hào)途徑來(lái)提高對(duì)病毒的抗性。
　　綜上所述，NtLTP4提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)生物和非生物脅迫的抗性，這些研