丹參素聯(lián)合丹皮酚對(duì)糖尿病大鼠基底動(dòng)脈的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　糖尿病大血管并發(fā)癥指心、腦及外周血管病變,包括冠心病、腦卒中和間歇性跛行與下肢壞疽,是糖尿病致死、致殘的主要原因,約占糖尿病病人死亡原因的60-70％[1]。尤其是糖尿病可引起腦動(dòng)脈血管功能障礙以致動(dòng)脈粥樣硬化,從而造成大腦長(zhǎng)期相對(duì)供血不足,導(dǎo)致缺血缺氧,甚至腦萎縮。其缺血性腦卒中發(fā)生率更是非糖尿病人群的2-4倍。目前,臨床上對(duì)于糖尿病大血管病變的治療仍以西藥為主,但西藥雖然療效較好確常伴發(fā)較明顯的毒副作用。

2、中藥因其低毒、多靶點(diǎn)等特點(diǎn),對(duì)于糖尿病大血管病變的治療有望帶來新的突破。糖尿病血管病變中醫(yī)病理機(jī)制在于痰濁瘀血阻滯于經(jīng)脈和絡(luò)脈系統(tǒng),這些有形之邪在脈道蓄積留滯的過程中不斷沉積,導(dǎo)致脈壁增厚,管腔狹窄;同時(shí),沉積物對(duì)脈壁不斷刺激,對(duì)脈壁組織產(chǎn)生侵蝕、灼傷等病理作用,最終導(dǎo)致脈壁結(jié)構(gòu)損傷[2]。因此,活血化瘀在中醫(yī)糖尿病血管病變治療中具有重要意義。
　　雙丹方出自《施今墨對(duì)藥》,由丹參、牡丹皮兩味中藥組成。具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效

3、。其制劑雙丹口服液分別收載于2005、2010年版《中國(guó)藥典》(一部),為中藥標(biāo)準(zhǔn)制劑。
　　丹皮酚(Pae)為牡丹皮中主要的活性成分之一[3-6]。同時(shí)在丹參中提取的水溶性化合物丹參素(DSS)在丹參藥效方面發(fā)揮重要作用[7-9]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,丹皮酚和丹參素分別對(duì)動(dòng)脈血管具有舒張作用[10,11],同時(shí)具有血管內(nèi)皮保護(hù)的功效[12,13]。近些年發(fā)現(xiàn)丹參素聯(lián)合丹皮酚具有良好的抗缺血再灌注損傷以及抗氧化的功效[14]。我們近期

4、觀察到丹參素聯(lián)合丹皮酚可提高丹皮酚在心臟和腦組織中的分布[15],同時(shí)能夠增強(qiáng)在心肌缺血再灌注損傷過程中的藥物功效[16]。是否丹皮酚聯(lián)合應(yīng)用丹參素同樣可以起到明顯的血管保護(hù)作用目前尚未見研究報(bào)道。本課題擬將分別來自丹參的丹參素和來自牡丹皮的丹皮酚,二者配伍組成成分組方,并與各單一成分及雙丹口服液進(jìn)行了藥效學(xué)比較研究。
　　糖尿病狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷,甚至發(fā)生凋亡,從而發(fā)生內(nèi)皮依賴性動(dòng)脈舒張功能的障礙[17,18]。與此同時(shí)

5、,動(dòng)脈平滑肌在糖尿病狀態(tài)下可表現(xiàn)為高反應(yīng)性,導(dǎo)致動(dòng)脈血管的張力增加[19,20]。其中很重要的一個(gè)原因?yàn)樘悄虿∫种破交〖?xì)胞鉀通道的活性,從而導(dǎo)致大量Ca2+內(nèi)流促使平滑肌處于高張力狀態(tài)[21,22]。據(jù)此本課題提出丹參素聯(lián)合丹皮酚有可能具有抗糖尿病血管功能衰竭的作用,且藥物效果要優(yōu)于單獨(dú)給藥;同時(shí)探討丹皮酚配伍丹參素對(duì)糖尿病大鼠基底動(dòng)脈損傷保護(hù)作用及其機(jī)理。
　　研究方法:
　　本實(shí)驗(yàn)分別借助實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型和高濃度葡

6、萄糖環(huán)境下動(dòng)脈血管內(nèi)皮/平滑肌細(xì)胞來評(píng)價(jià)丹參素聯(lián)合丹皮酚的血管保護(hù)作用。采用離體血管環(huán)灌流、PI-Hoechst細(xì)胞凋亡染色、MTT法、蛋白免疫印跡(Western blot)等實(shí)驗(yàn)方法,觀察:①丹參素聯(lián)合丹皮酚對(duì)糖尿病大鼠動(dòng)脈血管功能的作用;②丹參素聯(lián)合丹皮酚抗糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及相關(guān)機(jī)制;③丹參素聯(lián)合丹皮酚對(duì)糖尿病血管平滑肌細(xì)胞損傷的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　1、丹參素聯(lián)合丹皮酚可使大鼠基底動(dòng)脈血管

7、產(chǎn)生非內(nèi)皮依賴性舒張作用:伴隨著丹皮酚+丹參素濃度劑量的增加,對(duì)內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮動(dòng)脈環(huán)的舒張作用均呈明顯加強(qiáng),且呈濃度依賴性。內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮動(dòng)脈環(huán)對(duì)丹皮酚+丹參素的反應(yīng)無顯著性差異。說明丹皮酚+丹參素所誘導(dǎo)的基底動(dòng)脈舒張作用為非內(nèi)皮依賴舒張作用。
　　2、長(zhǎng)期給予丹參素聯(lián)合丹皮酚對(duì)糖尿病大鼠基底動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響:長(zhǎng)期給予丹參素聯(lián)合丹皮酚可增加乙酰膽堿(ACh)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠基底動(dòng)脈血管環(huán)舒張作用。糖尿病組ACh誘導(dǎo)

8、的血管環(huán)舒張作用明顯減小,與對(duì)照組存在顯著性差異(p<0.01)。各藥物干預(yù)組不同程度地加大ACh誘導(dǎo)的血管環(huán)舒張反應(yīng)。丹皮酚+丹參素組動(dòng)脈血管環(huán)舒張作用較各單一成分給藥組明顯增強(qiáng)(p<0.05),與雙丹口服液組無顯著性差異。
　　3、長(zhǎng)期給予丹參素聯(lián)合丹皮酚處理后對(duì)去氧腎上腺素(PE)致糖尿病大鼠基底動(dòng)脈環(huán)收縮作用的影響:長(zhǎng)期給予丹參素聯(lián)合丹皮酚處理后可降低因去氧腎上腺素(PE)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠基底動(dòng)脈血管(內(nèi)皮完整/去內(nèi)皮)收

9、縮作用。糖尿病組動(dòng)脈環(huán)收縮反應(yīng)明顯強(qiáng)于對(duì)照組(p<0.01)。糖尿病大鼠給予丹皮酚+丹參素以及各單一成分灌胃8周處理。PE誘導(dǎo)各藥物處理組血管環(huán)收縮反應(yīng)均弱于糖尿病組動(dòng)脈血管環(huán)。其中以丹參素聯(lián)合丹皮酚共同處理組大鼠動(dòng)脈環(huán)(內(nèi)皮完整/去內(nèi)皮)收縮程度最弱(p<0.01)。同時(shí),各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮大鼠動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)PE誘導(dǎo)的收縮增加幅度分別存在顯著性差異。其中,丹皮酚+丹參素處理組血管環(huán)內(nèi)皮完整與去內(nèi)皮狀態(tài)下收縮幅度差異最為明顯(p<0

10、.01),幅度差異大于丹皮酚和丹參素單獨(dú)給藥組(p<0.05)。與雙丹口服液組無顯著性差異。
　　4、長(zhǎng)期給予丹參素聯(lián)合丹皮酚對(duì)糖尿病大鼠基底動(dòng)脈 SOD活性和 TBARS水平的影響:各藥物治療組(丹皮酚,丹參素,丹皮酚+丹參素)動(dòng)脈組織樣本 SOD活性均明顯升高(p<0.05),丹參素聯(lián)合丹皮酚組SOD活性最高(p<0.01)。而TBARS水平在給予藥物治療組均較糖尿病組有所降低(p<0.05),以丹參素聯(lián)合丹皮酚組最為顯著(p

11、<0.01)。
　　5、丹參素聯(lián)合丹皮酚急性干預(yù)后對(duì)CaCl2致基底動(dòng)脈環(huán)收縮作用的影響:丹皮酚+丹參素預(yù)孵正常與糖尿病大鼠去內(nèi)皮血管環(huán)后,隨即CaCl2誘導(dǎo)濃度依賴性血管環(huán)收縮反應(yīng)。通過血管環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過丹皮酚+丹參素孵育后正常與糖尿病大鼠去內(nèi)皮血管環(huán)均表現(xiàn)出顯著的相對(duì)性張力減低反應(yīng)。以糖尿病大鼠血管環(huán)表現(xiàn)最為明顯(p<0.01)。提示丹皮酚+丹參素在一定程度上抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流,從而降低了血管對(duì)CaCl2誘導(dǎo)的

12、收縮反應(yīng)。
　　6、鉀通道阻斷劑對(duì)丹參素聯(lián)合丹皮酚舒張血管作用的影響:TEA(非特異性鉀通道阻斷劑)預(yù)處理可部分阻斷丹皮酚+丹參素誘導(dǎo)的血管平滑肌舒張反應(yīng)(p<0.01νs Pae+DSS組;p<0.05νs DM+Pae+DSS組)。提示丹皮酚+丹參素在一定程度上抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流是通過活化血管平滑肌K+通道來實(shí)現(xiàn)的。
　　7、丹參素聯(lián)合丹皮酚對(duì)高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響:丹參素聯(lián)合丹皮酚可有效抑制

13、高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(p<0.01),且觀察到p-p38蛋白表達(dá)減少(p<0.01)。
　　8、丹參素聯(lián)合丹皮酚對(duì)高糖環(huán)境下血管平滑肌細(xì)胞BKCa-β1蛋白表達(dá)的影響:丹參素聯(lián)合丹皮酚可有效增強(qiáng)高濃度葡萄糖環(huán)境下血管平滑肌細(xì)胞 BKCa-β1的蛋白表達(dá)(p<0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1、國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)了丹參素聯(lián)合丹皮酚具有抗糖尿病動(dòng)脈血管內(nèi)皮功能障礙作用,能顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞因高糖所致的凋亡,且