鴨源致病性大腸桿菌Ⅰ型菌毛pilA基因序列分析與原核表達產(chǎn)物免疫原性研究.pdf

1、本文根據(jù)GenBank中人源大腸桿菌pilA基因序列，用OLIG06.0設計PCR引物，對甘露糖敏感血凝試驗(MSHA)檢測陽性的鴨源致病性大腸桿菌pilA基因進行PCR擴增、序列測定及生物信息學分析；并對pilA基因進行原核表達和免疫原性檢測，獲得如下結果： 應用MSHA對實驗室分離、鑒定的185株鴨源致病性大腸桿菌進行Ⅰ型菌毛檢測，陽性率為65.9％(122/185)；選取25株MSHA陽性的菌株，用PCR擴增其pilA基因

2、，其中21株為陽性，陽性率為84％。 測定和分析了5株(GH1.2,CY1.3,EM2.5,SL3.2,YL4.3)鴨源致病性大腸桿菌pilA基因表明：鴨源致病性大腸桿菌pilA基因大小為549bp，編碼182aa，各株之間pilA基因核苷酸同源性為92.4％-100.0％，所編碼氨基酸同源性為92.9％-100％；與人源、雞源及豬源大腸桿菌pilA基因之間核苷酸同源性為87.3％-99.8％，氨基酸同源性為87.5％-99.5

3、％。對不同宿主來源大腸桿菌pilA基因所編碼蛋白的二級結構、親水性、抗原性、抗原表位進行預測分析比較，結果顯示Ⅰ型菌毛間具有一定的結構相似性，并存在一定的共同抗原位點；系統(tǒng)進化樹分析表明，各菌株間的遺傳相關性與其宿主來源及血清型之間沒有嚴格的關系。 對菌株GH1.2擴增的pilA基因進行pMD18-T載體克隆，通過對pMD18-T-pilA及pET-32a(+)進行BamHⅠ、HindⅢ雙酶切、連接，將pilA基因定向插入pET

4、-32a(+)，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定表明，成功構建重組表達質(zhì)粒pET-32a-pilA，并轉化入表達宿主菌BL21(DE3)，用IPTG進行誘導表達，表達產(chǎn)物以融合表達的包涵體形式存在，大小為36kD左右。對表達條件進行優(yōu)化，確定最佳表達條件為IPTG0.2mmol/L，誘導4h。 表達產(chǎn)物用SDS-PAGE切膠及利用重組表達蛋白所帶的6×His標簽用鎳柱親和層析兩種方法對其進行純化，均獲得較好的純化效果。純化后產(chǎn)