Pim-2通過NF-κB通路激活API-5抑制肝癌細胞凋亡.pdf

1、目的：探討肝癌細胞中癌基因Pim-2及其可能的下游因子NF-κB與API-5三者之間的關系，初步明確肝癌細胞中Pim-2抗凋亡的信號通路，證實Pim-2可通過NF-κB通路激活API-5，從而抑制肝癌細胞凋亡、促進肝癌的發(fā)生發(fā)展。
　　 方法：（1）收集臨床手術切除的肝細胞癌組織及相應癌旁組織各27例，以同期行非腫瘤性肝葉切除術的正常肝組織11例為對照，設置臨床標本實驗組共3組：肝細胞癌組織組、癌旁組織組和正常肝組織組。（2）通

2、過Real-time PCR檢測上述各組標本中Pim-2、NF-κB和API-5的mRNA水平；通過免疫組織化學和Western blotting分別檢測上述各組標本中Pim-2、tAPI-5和pAPI-5的蛋白水平；通過EMSA檢測上述各組標本中NF-κB的活性度。（3）構建攜帶人Pim-2基因的真核表達質粒，并將其轉染入非腫瘤性人肝細胞L02細胞株，以未轉染細胞及轉染空載體的細胞為對照；設計針對Pim-2的特異性SiRNA，導入真核

3、表達載體pGenesil-1，并將其轉染入人肝癌細胞HepG2細胞株，以未轉染細胞和轉染空載體的細胞為對照（前期完成）。（4）設置細胞實驗組共8組：非腫瘤性人肝細胞L02細胞組、轉染Pim-2的L02細胞組、轉染空載體的L02細胞組、人肝癌細胞HepG2細胞組、轉染Pim-2SiRNA的HepG2細胞組、轉染空載體的HepG2細胞組、L02/Pim-2+銀膠菊內酯（NF-κB信號通路特異性抑制劑）組、HepG2+銀膠菊內酯組。（5）通過

4、Real-time PCR檢測上述各組細胞中Pim-2，NF-κB和API-5的mRNA水平；通過Western blotting檢測上述各組細胞中Pim-2，tAPI-5和pAPI-5的蛋白水平；通過EMSA檢測上述各組細胞核蛋白中NF-κB的活性度；通過AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測上述各組細胞的凋亡率。
　　 結果：（1）臨床標本實驗發(fā)現(xiàn)：肝癌組織中Pim-2、NF-κB和API-5的mRNA水平較癌旁組織和正

5、常肝組織中顯著增高（p<0.05）；肝癌組織中Pim-2、tAPI-5和pAPI-5蛋白呈陽性表達，而癌旁組織和正常肝組織中呈陰性表達；肝癌組織中Pim-2、tAPI-5和pAPI-5的蛋白水平較癌旁組織和正常肝組織中顯著增高（p<0.05）；肝癌組織中NF-κB活性度較癌旁組織和正常肝組織中顯著增高（p<0.05）。（2）細胞實驗發(fā)現(xiàn)：轉染Pim-2的L02細胞中Pim-2的mRNA和蛋白水平較對照組顯著增高（p<0.05）；轉染Pi

6、m-2 SiRNA的HepG2細胞中Pim-2的mRNA和蛋白水平較對照組顯著降低（p<0.05）。在各實驗組細胞中，NF-κB和API-5的mRNA水平隨著Pim-2 mRNA水平的變化而平行變化；tAPI-5和pAPI-5的蛋白水平及NF-κB活性度也隨著Pim-2蛋白水平的變化而平行變化。在高表達Pim-2的L02/Pim-2細胞和HepG2細胞中加入NF-κB特異性抑制劑銀膠菊內酯后，Pim-2 mRNA及蛋白表達無顯著變化，但

7、其中NF-κB、API-5的mRNA水平，pAPI-5和tAPI-5的蛋白水平及NF-κB活性度均顯著降低（p<0.05）。各實驗組細胞凋亡率與Pim-2的表達水平無直接關系，而與pAPI-5的水平呈反向平行變化趨勢。
　　 結論：（1）臨床標本實驗提示：Pim-2、NF-κB和API-5可能是與肝癌發(fā)生發(fā)展相關的某信號通路上的相關因子。（2）細胞實驗進一步證實：Pim-2可通過磷酸化作用激活API-5從而抑制肝癌細胞凋亡，而N