特異2’OMe修飾siRNA對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞VEGF表達(dá)及細(xì)胞增殖凋亡的影響.pdf

1、目的：篩選有效的干擾序列，研究靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascuar endothelial growth factor, VEGF)的特異性小干擾RNA(siRNA)對(duì)人前列腺癌DU145細(xì)胞增殖及凋亡的影響為針對(duì)VEGF基因的RNA干擾提供新的有效的作用靶位，為針對(duì)VEGF的前列腺癌基因治療提供新的途徑。
　　 方法：1．設(shè)計(jì)并體外化學(xué)合成3對(duì)針對(duì)人VEGF基因的特異性siRNA和綠色熒光素標(biāo)記的FAM-siRNA作為陰性對(duì)照

2、序列，并對(duì)siRNA進(jìn)行特異2'OMe修飾。
　　 2．利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將FAM-siRNA轉(zhuǎn)染入人前列腺癌DU145細(xì)胞；通過熒光顯微鏡檢測(cè)表達(dá)綠色熒光素的DU145細(xì)胞，評(píng)估siRNA的轉(zhuǎn)染效率：通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染3對(duì)siRNA，并設(shè)置空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的DU145細(xì)胞提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)測(cè)定各組轉(zhuǎn)染不同序列siRNA的DU145細(xì)胞VEGF的mRNA表達(dá)水平，篩選出具有最大抑制作用的特異

3、性siRNA作為最佳序列；隨后將不同濃度的已篩選出的最佳序列siRNA轉(zhuǎn)染入DU145細(xì)胞，利用RT-PCR法檢測(cè)其VEGF mRNA的表達(dá)，篩選其最佳轉(zhuǎn)染濃度。
　　 3．將以最佳濃度的最佳序列siRNA轉(zhuǎn)染入DU145細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞并提取總蛋白，利用Western Blot法檢測(cè)其VEGF蛋白表達(dá)水平，計(jì)算抑制率；四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)法檢測(cè)其細(xì)胞增殖，Annexin V-PI法檢測(cè)細(xì)胞早、晚期凋亡情況。

4、>　　 結(jié)果：熒光顯微鏡觀察檢測(cè)顯示，F(xiàn)AM-siRNA轉(zhuǎn)染效率大于75％；以200nM濃度轉(zhuǎn)染人前列腺癌DU145細(xì)胞，siRNA-1和siRNA-3轉(zhuǎn)染組VEGF mRNA的表達(dá)水平有不同程度的下調(diào)，其中以siRNA-1轉(zhuǎn)染組下調(diào)最明顯，表達(dá)率約為(42.4±6.8)％，與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA-2組和siRNA-3相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，選為最佳特異性siRNA;以三種濃度(100nM、200nM、3

5、00nM)轉(zhuǎn)染siRNA-1至DU145細(xì)胞，當(dāng)濃度為300nM時(shí)，VEGF基因的干擾效率達(dá)到最高，其VEGF mRNA表達(dá)率約為(22.1±13.6)％，與空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染100nM、200nM濃度組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Western-blot法檢測(cè)以300nM濃度為最適轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染siRNA-1，其VEGF蛋白表達(dá)率約為(26.8±10.5)％，與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);MT