茶樹(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1調(diào)控花青素的作用機(jī)制研究.pdf

1、花青素是植物界中最大的水溶性色素家族，也是類(lèi)黃酮類(lèi)家族中的一員。在植物體內(nèi)，花青素充當(dāng)著響應(yīng)生理和環(huán)境變化的保護(hù)機(jī)制，有利于植物應(yīng)對(duì)各種生物和非生物脅迫?；ㄇ嗨剡€是一種天然的抗氧化劑，能夠保護(hù)人體免受自由基等有害物質(zhì)的傷害，并且在增強(qiáng)血管彈性、預(yù)防心腦血管疾病、保護(hù)肝臟等方面有著重要的作用。此外，花青素作為一種天然無(wú)害色素，在食用色素開(kāi)發(fā)中有著廣泛的應(yīng)用前景。在模式植物、花卉以及果樹(shù)中花青素的合成及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制已研究得較為清楚，但是關(guān)于

2、茶樹(shù)花青素代謝途徑轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制及轉(zhuǎn)錄因子的作用機(jī)理尚不明確。
　　本文以高花青素含量茶樹(shù)品種“紫娟”（Camellia sinensisvar．a(chǎn)ssamica，cv.Zijuan）為材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和qRT-PCR找到了四個(gè)與類(lèi)黃酮類(lèi)合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子。其中CsAN1的表達(dá)量與“紫娟”中花青素的含量呈極顯著的相關(guān)性，因此我們對(duì)其做了進(jìn)一步的功能驗(yàn)證，結(jié)果如下：
　　1.以“紫娟”葉片cDNA為模板，克隆了C

3、sAN1、CsGL3、CsEGL3以及CsTTG1的全長(zhǎng)，并對(duì)這幾個(gè)基因的氨基酸序列進(jìn)行分析和聚類(lèi)。其中CsAN1具有R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)構(gòu)特征，并具有bHLH的結(jié)合位點(diǎn)和調(diào)控花青素合成的KPRPR[S/T]F結(jié)構(gòu)域。聚類(lèi)分析表明CsAN1與中華獼猴桃中調(diào)控花青素合成基因AcMYB110的相似性最高，達(dá)到58％。
　　2. CsAN1轉(zhuǎn)化本氏煙草促進(jìn)花青素的積累為了檢測(cè)CsAN1在植物體的功能，構(gòu)建了35S::CsAN

4、1超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化本氏煙草。CsAN1異位表達(dá)促進(jìn)了煙草葉片花青素的積累，并導(dǎo)致花青素合成結(jié)構(gòu)基因上調(diào)表達(dá)，這說(shuō)明CsAN1參與植物花青素的合成。
　　3. CsAN1具有轉(zhuǎn)錄激活功能并能結(jié)合到CsLDOX1和CsLDOX2的啟動(dòng)子上反式激活和酵母單雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：CsAN1具有自主激活功能，并且能結(jié)合到花青素合成關(guān)鍵基因CsLDOX1和CsLDOX2的啟動(dòng)子上。這說(shuō)明CsAN1能參與調(diào)控茶樹(shù)花青素的合成。
　　4. CsA

5、N1是MBW復(fù)合物的成員酵母雙雜交與雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：CsAN1與 CsGL3、CsEGL3互作，但不與CsTTG1互作，而CsTTG1也能與CsGL3、CsEGL3互作，這暗示暗示了茶樹(shù)中也 CsAN1、CsGL3、CsEGL3和 CsTTG1可能形成 MBW存在有 MYB、bHLH和WD40重復(fù)蛋白形成的MBW三元復(fù)合物形式轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。
　　5. MBW復(fù)合物轉(zhuǎn)錄調(diào)控CsLDOX2啟動(dòng)子的活性雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)

6、結(jié)果顯示：CsAN1能提高CsLDOX2啟動(dòng)子的活性。同時(shí)共轉(zhuǎn)CsAN1、CsTTG1和CsGL3三個(gè)基因，CsLDOX2啟動(dòng)子活性提高更為顯著。這也從側(cè)面輔助證明了CsAN1是通過(guò)形成MBW復(fù)合物調(diào)控花青素合成基因的表達(dá)。
　　6.“紫娟”CsAN1啟動(dòng)子的低甲基化水平與高花青素含量相關(guān)利用hiTAIL PCR技術(shù)從四個(gè)不同茶樹(shù)品種中克隆出CsAN1的啟動(dòng)子序列，之后用亞硫酸氫鹽測(cè)序分析了“紫娟”和其他綠葉茶樹(shù)品種CsAN1啟動(dòng)