大鼠損傷脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞-前體細(xì)胞增殖、分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinalcordinjur,SCI)是一種嚴(yán)重傷病，其致殘率極高。SCI的傳統(tǒng)治療方法有脊柱骨折脫位的復(fù)位固定、解除壓迫、對癥、預(yù)防并發(fā)癥及功能康復(fù)鍛煉治療。近年來，隨著神經(jīng)病理生理及神經(jīng)發(fā)育學(xué)研究的不斷深入，神經(jīng)組織不能再生的傳統(tǒng)觀念受到了挑戰(zhàn)。尤其是神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralstemcells,NSCs)的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，為治療包括脊髓損傷在內(nèi)的難治性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Centerneuralsystem，CNS)疾病開辟了新的

2、道路。 神經(jīng)干細(xì)胞具有分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，并具有很強(qiáng)的自我更新能力和增殖潛能，因此具有非常重要的理論研究和臨床應(yīng)用價(jià)值。通過移植大量的細(xì)胞特別是神經(jīng)干細(xì)胞來促進(jìn)損傷脊髓的功能恢復(fù)已經(jīng)取得了令人鼓舞的結(jié)果，但誘導(dǎo)動(dòng)員內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞來修復(fù)脊髓損傷方面的研究關(guān)注較少；與移植細(xì)胞相比，激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞因是利用自身資源，它不僅克服了從組織獲取神經(jīng)干細(xì)胞的危險(xiǎn)性和局限性，也避免了組織細(xì)胞移植中存在的倫理、免

3、疫排斥、來源有限等問題，因此在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域?qū)?huì)有廣闊的應(yīng)用前景。 雖然神經(jīng)干細(xì)胞的研究取得了一定的進(jìn)展，但對內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞仍了解很少，尤其是對其體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制仍不明確。因此，在本研究中，利用BrdU標(biāo)記內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞的方法，我們觀察了大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞增殖、分化的規(guī)律。此外，鑒于WNT-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化中起了重要作用，我們探索了是否應(yīng)用外

4、源性。WNT-1能提高脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞的增殖、分化。 第一部分: 大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞增殖、分化的研究 目的：探討脊髓損傷對大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞的影響。 方法： (一)、雌性SD大鼠36只，隨機(jī)均分為對照組(A組)、預(yù)標(biāo)記組(B組)和損傷后標(biāo)記組(C組)。 (二)、采用改良Allen法建立脊髓損傷模型。 (三)、A組、B組采用5-溴2-脫氧

5、尿嘧啶核苷(5-bromo2-deoxyuridine,BrdU)連續(xù)10d腹腔注射標(biāo)記脊髓內(nèi)保持分化活力的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞，B組于第11d行脊髓損傷；C組采用脊髓損傷后連續(xù)10d腹腔注射Brdu來標(biāo)記損傷后活化增殖的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞，按照相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取材，進(jìn)行免疫組化染色，探討大鼠脊髓損傷對內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞的影響。 結(jié)果： A組可見整個(gè)脊髓切片均有大量的Brdu陽性細(xì)胞存在，這些細(xì)胞主要分

6、布于脊髓外側(cè)區(qū)域；與A組相比較，B組Brdu陽性細(xì)胞在損傷后1d明顯減少，7d后增多，21d后逐漸恢復(fù)并超過A組水平；C組在損傷后1d即見大量Brdu陽性細(xì)胞增殖，陽性細(xì)胞數(shù)亦較預(yù)標(biāo)后損傷1d時(shí)明顯增多，損傷后7dBrdu陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，并超出A組水平，這些細(xì)胞分布于損傷周圍的灰質(zhì)及室管膜區(qū)，但在損傷后21d，Brdu陽性細(xì)胞數(shù)未見繼續(xù)增加。并且，與A組相比，C組有較多的巢蛋白(Nestin)陽性細(xì)胞在室管膜區(qū)表達(dá)，1d即有增加，在

7、7d達(dá)到高峰，21d減少。 結(jié)論： 正常大鼠脊髓中存在著有分化能力的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞，它們保持增生、分化活性狀態(tài)，對損傷反應(yīng)敏感，在損傷后明顯減少或喪失；脊髓中存在著另一種處于緩慢活化狀態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞，它們在損傷后明顯被激活，快速增殖、分化，替代喪失的細(xì)胞，從而參與脊髓創(chuàng)傷的修復(fù)過程。 第二部分：WNT-1對脊髓損傷大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞增殖、分化的影響 目的：探討WNT-1對

8、大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞的影響。 方法：利用Allen重物墜落WD法制作大鼠脊髓損傷模型，隨機(jī)分為對照組(A組)和WNT-1組(B組)，分別通過蛛網(wǎng)膜下腔給與生理鹽水和WNT-1，每日1次，共7d。采用BrdU腹腔注射標(biāo)記脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞，觀察比較各組大鼠制模后第7d、14d、21dBrdu陽性細(xì)胞的表達(dá)。 結(jié)果：制模后，兩組大鼠傷段脊髓均可見Brdu陽性細(xì)胞增殖，且陽性細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間遞減；與

9、對照組相比，WNT-1組Brdu陽性細(xì)胞顯著增加，且7d組Brdu陽性細(xì)胞數(shù)最多。同時(shí)WNT-1組有較多的Nestin陽性細(xì)胞在室管膜區(qū)表達(dá)，其在7d達(dá)到高峰，21天減少。 結(jié)論：應(yīng)用WNT-1可促進(jìn)大鼠脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞的增殖及分化。 小結(jié)： 1.正常大鼠脊髓中保持活性的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞對損傷反應(yīng)敏感，它們在脊髓損傷后大部分喪失或明顯減少，這些損失的細(xì)胞迅速被第二種處于靜止?fàn)顟B(tài)的干細(xì)胞/前