HIF-1α及VEGF在大鼠缺血缺氧性腦損傷中的表達(dá)研究.pdf

1、腦卒中(Cerebral Stroke)是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)致死性疾病，多年來，它以高發(fā)病率、高致殘率和高病死率嚴(yán)重地威脅著人類的健康。其中缺血性腦卒中(Ischemic CerebralStroke)占絕大部分(約60-80％)，目前臨床上常見的溶栓及開顱手術(shù)等治療受到諸多因素的限制僅對(duì)少數(shù)患者有效，因此進(jìn)一步闡明其分子機(jī)制以及探索新的治療方案已經(jīng)迫在眉睫。 目的：本研究旨在建立了一種大鼠永久性大腦中動(dòng)脈缺血模型。采用神經(jīng)功能缺

2、失行為學(xué)評(píng)分、TTC染色測(cè)定梗死范圍、大鼠腦組織的組織病理學(xué)及電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察等對(duì)模型予以評(píng)價(jià)；并進(jìn)一步探討HIF-1α、VEGF在腦缺血缺氧性腦損傷中的表達(dá)規(guī)律及其分子機(jī)制，為探討行之有效的治療方法提供理論依據(jù)。 方法： 1.動(dòng)物分組：取體重250-280g健康成年SD大鼠80只，隨機(jī)分3組：正常對(duì)照組大鼠5只，實(shí)驗(yàn)組50只，假手術(shù)組25只，按梗塞后不同取材時(shí)間分為6h、12h、24h、72h、7d 5個(gè)亞組。

3、 2.模型制備：實(shí)驗(yàn)組使用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型。假手術(shù)組除不插線栓外，操作步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。各組大鼠術(shù)后行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，1～3分者入選實(shí)驗(yàn)。 3.大鼠于預(yù)定時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦，使用TTC染色觀察腦梗塞范圍。 4.HE染色光鏡觀察大腦中動(dòng)脈缺血大鼠腦組織病理學(xué)改變，透射電鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化。 5.免疫組化SP法測(cè)定各腦區(qū)HIF-1α、VEGF表達(dá)。顯微鏡下觀察陽性表達(dá)情況，使用Image-Pro P

4、lus 5.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每個(gè)視野陽性染色區(qū)域的平均光密度值。應(yīng)用SPSS15.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 1.成功制備了大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型。栓塞后的大鼠均表現(xiàn)出不同程度的偏癱癥狀，如身體傾斜、爬行旋轉(zhuǎn)等癥狀。 2.腦組織行TTC染色可見正常腦組織呈鮮紅色，梗死區(qū)腦組織呈蒼白色，并且隨著梗塞時(shí)間的延長可見梗塞區(qū)擴(kuò)大。 3.大腦組織學(xué)及神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的觀察可見，24h后梗塞中心區(qū)出現(xiàn)大量神

5、經(jīng)元壞死，呈不可逆性，隨著時(shí)間延長，壞死程度加重，壞死范圍擴(kuò)大；缺血半暗區(qū)部分神經(jīng)元壞死，多數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損但呈可修復(fù)性。 4.HIF-1α在正常對(duì)照組及假手術(shù)組偶可見少量陽性細(xì)胞。缺血6h，梗塞側(cè)缺血中心區(qū)、缺血半暗區(qū)及梗塞對(duì)側(cè)HIF-1α表達(dá)均增加；缺血12h，各腦區(qū)HIF-1α表達(dá)繼續(xù)增高；缺血24h，梗塞側(cè)皮層中心壞死區(qū)HIF-1α表達(dá)下降，而缺血半暗區(qū)及對(duì)側(cè)皮層表達(dá)均繼續(xù)增高并達(dá)高峰；缺血3d，各腦區(qū)HIF-1α的表達(dá)均

6、開始下降。缺血7d，各腦區(qū)HIF-1α的表達(dá)繼續(xù)降低到較低水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，HIF-1α蛋白水平的表達(dá)在正常對(duì)照組與假手術(shù)組之間無明顯差異(P>0.05)，而各實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組及假手術(shù)組比較顯示HIF-1α表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 5.VEGF在正常對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠的腦組織中，VEGF僅見少量表達(dá)。缺血6h，梗塞側(cè)缺血中心區(qū)、缺血半暗區(qū)及梗塞對(duì)側(cè)VEGF蛋白水平表達(dá)均增加。缺血12h，梗塞側(cè)

7、皮層中心壞死區(qū)VEGF表達(dá)下降，而缺血半暗區(qū)及對(duì)側(cè)皮層表達(dá)均繼續(xù)增高；缺血24h，梗塞側(cè)皮層中心壞死區(qū)VEGF表達(dá)繼續(xù)降低，而缺血半暗區(qū)及梗塞對(duì)側(cè)皮層VEGF表達(dá)繼續(xù)增高并達(dá)高峰；缺血3d，各腦區(qū)VEGF的表達(dá)均下降；缺血7d，各腦區(qū)VEGF的表達(dá)持續(xù)下降至較低水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,VEGF蛋白水平的表達(dá)在正常對(duì)照組與假手術(shù)組之間無明顯差異(P>0.05)，而各實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組及假手術(shù)組之間比較顯示VEGF表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)意義(P<0.05)。 6.HIF-1α與VEGF蛋白水平的表達(dá)在大鼠大腦中動(dòng)脈缺血后的腦組織中呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.7153，P<0.05，相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.使用線栓法可成功復(fù)制大腦中動(dòng)脈缺血模型。經(jīng)神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分、TTC染色、大體觀察、HE染色組織學(xué)觀察及電鏡下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察證實(shí)造模成功。 2.腦梗塞24h-72h時(shí)間段，腦損傷程度最重，梗塞中心區(qū)神經(jīng)元明顯壞死，并且隨著時(shí)間

9、的延長，壞死程度漸加重，呈不可逆性；缺血半暗區(qū)部分神經(jīng)元壞死，多數(shù)組織呈可修復(fù)性，尚存在挽救的機(jī)會(huì)。 3.HIF-1α只在一定氧濃度范圍內(nèi)表達(dá)，梗塞中心區(qū)完全缺氧情況下，神經(jīng)元壞死后則無表達(dá)；缺血半暗區(qū)存在一定程度缺氧，HIF-1α在此處的神經(jīng)元中存在明顯高表達(dá)。 4.HIF-1α與VEGF于缺血梗塞24h時(shí)蛋白表達(dá)水平達(dá)到高峰，隨梗塞時(shí)間的延長其表達(dá)水平呈峰樣變化。 5.在缺血梗塞后，HIF-1α與VEGF在腦