大黃素調(diào)節(jié)p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抗糖尿病大鼠腎損傷的研究.pdf

1、糖尿病腎損傷(DiabeticNephropathy)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因。P38MAPK是MAPK家族的一員，同JNK一起屬于應(yīng)激活化蛋白。P38MAPK可以被多種應(yīng)激因素所激活，如高血糖、高滲透壓、氧化應(yīng)激、以及一些炎癥因子等。激活后的P38MAPK可以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化和凋亡。糖尿病狀態(tài)下蛋白質(zhì)非酶糖化、多元醇通路激活、二?；视蚉KC通路激活及氧化應(yīng)激等因素都可激活P38MAPK，進(jìn)而磷酸化轉(zhuǎn)

2、錄因子，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與DN的發(fā)生與發(fā)展。體外研究表明：高血糖可以激活腎細(xì)胞的P38MAPK信號通路，誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞P38MAPK的磷酸化，使腎臟細(xì)胞外基質(zhì)如纖維連接蛋白FN等表達(dá)增多。因此，有學(xué)者認(rèn)為：P38MAPK是高糖引起糖尿病腎損傷的信號傳遞子，抑制P38MAPK通路的激活，可以減少腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)的形成，減輕腎纖維化，阻止或減緩糖尿病腎損傷的發(fā)生與發(fā)展。大黃素(1、3、8-三羥基-6甲基蒽醌)是中藥大黃抗糖尿病腎病

3、、保護(hù)腎功能的主要活性成分。大黃素能以劑量依賴方式抑制成纖維細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞的增殖，其機(jī)制是抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。大黃素可以通過調(diào)節(jié)c-myc基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡、抑制間質(zhì)纖維化。大黃素產(chǎn)生這些作用的機(jī)理不明，目前還未見有相關(guān)的報(bào)道。既往的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病狀態(tài)下，大黃素?zé)o明顯的降血糖作用，表明它抗糖尿病腎損傷的作用與血糖水平無關(guān)。有研究表明，部分糖尿病病人的血糖即使控制在正常范圍，糖尿病腎損傷仍持續(xù)發(fā)生、發(fā)展，可見高血糖并

4、不是引起糖尿病腎損傷的唯一因素。通過計(jì)算機(jī)藥物分子設(shè)計(jì)分析，我們發(fā)現(xiàn)大黃素分子能夠與P38MAPK空間三維結(jié)構(gòu)的疏水基團(tuán)結(jié)合，提示大黃素可能直接作用于P38MAPK。因此，我們推測大黃素抗糖尿病腎損傷、保護(hù)腎功能的作用可能與其抑制P38MAPK信號通路的激活有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病腎損傷大鼠模型上，觀察大黃素對糖尿病腎損傷大鼠腎功能的保護(hù)作用；并通過測定大黃素對腎組織磷酸化P38MAPK、核轉(zhuǎn)錄因子—磷酸化應(yīng)答元件

5、結(jié)合蛋白(CREB)及腎小球系膜外基質(zhì)(ECM)的主要成分--纖維連接蛋白(FN)的影響，探討大黃素對P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響及其抗糖尿病大鼠腎損傷的作用機(jī)制。 材料和方法 30只wistar大鼠，體重250±20g,隨機(jī)分為3組：正常組、模型組、大黃素組，每組10只，大鼠禁食6小時(shí)后，模型組和大黃素組按60mg/Kg.BW的劑量單次腹腔注射STZ，正常對照組注射等體積枸櫞酸緩沖液，72h后大鼠禁食6小時(shí)，尾靜脈

6、取血，測定血糖，血糖≥16.7mmol/L為造模成功。模型成功次日，大黃素組按40mg/kg的劑量灌胃給藥，模型對照組及正常對照組均灌胃給予等體積的0.5％醋酸纖維鈉溶液。實(shí)驗(yàn)第12周時(shí)，收集標(biāo)本進(jìn)行檢測，血糖用葡萄糖氧化酶法檢測，BUN、Scr分別用酶法、速率法由BeckmanCX-5全自動生化分析儀進(jìn)行檢測,UPE測定用磺基水楊酸—硫酸鈉比濁法。常規(guī)方法制備石臘切片，作HE染色，應(yīng)用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)6

7、.0測定腎小球平均面積(HCPA)、平均體積(MCV)。免疫組化檢測磷酸化P38，磷酸化CREB在腎臟的定位表達(dá)，western-blot檢測腎臟總P38，磷酸化P38，磷酸化CREB，及纖維連接蛋白的半定量表達(dá)。 結(jié)果 一：大黃素對STZ糖尿病腎損傷大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)的變化影響：與正常對照組相比，實(shí)驗(yàn)第12周時(shí)模型對照組體質(zhì)量明顯下降，腎質(zhì)量明顯增加，肥大指數(shù)(腎重/體重)增加，腎小球面積、腎小球體積明顯增加，血糖、2

8、4小時(shí)尿蛋白、血肌酐、尿素氮等也明顯升高(P均＜0.05)，提示糖尿病腎損傷大鼠模型成功；大黃素組的腎重、肥大指數(shù)、腎小球面積、腎小球體積、24小時(shí)尿蛋白、血肌酐、尿素氮等與糖尿病模型組相比明顯降低(P均＜0.05)，而血糖與模型組相比，雖有降低的趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)。 二：大黃素對P38MAPK蛋白的影響免疫組化顯示：P-P38MAPK主要表達(dá)在腎小球系膜細(xì)胞及腎小管細(xì)胞胞漿內(nèi)，偶有胞核表達(dá)，模型組磷酸化P38

9、MAPK陽性表達(dá)相對百分含量明顯高于正常組、大黃素組(P均＜0.05)。 westernblot檢測表明，模型組磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)為正常對照組的1.98倍(P＜0.05)，為大黃素組的1.82倍(P＜0.05)；正常組和大黃素組表達(dá)無顯著性差異(p＞0.05)；模型組T-P38MAPK表達(dá)高于正常組和大黃素組，但三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；P-P38MAPK與T-P38MAPK的比值，正常組、模型組和大黃素組

10、分別為：0.937、1.393、0.947。 三：大黃素對磷酸化CREB的影響免疫組化顯示：磷酸化CREB主要表達(dá)在腎小球系膜細(xì)胞，臟層上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞胞核內(nèi)，小管也有部分表達(dá)；模型組磷酸化CREB陽性表達(dá)相對百分含量明顯高于正常組、大黃素組(P＜0.05)。westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)第12周時(shí)，模型組P-CREB灰度均值為正常組的1.94倍(P＜0.05)，大黃素的1.63倍(P＜0.05)，正常組和大黃素組灰度值

11、無顯著性差異(p＞0.05)，三組P-CREB的變化趨勢與P-P38MAPK變化趨勢相同。 四：大黃素對FN的影響westernblot結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)第12周時(shí)，模型組FN的表達(dá)明顯增多，分別為正常對照組的1.96倍(P＜0.05)、大黃素組的1.60倍(P＜0.05)；正常組和大黃素組灰度值無顯著性差異(p＞0.05)。 結(jié)論 鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎損傷大鼠模型腎功能明顯受損，腎組織P-P38MAPK，P-C