犬瘟熱病毒和犬細(xì)小病毒的分離與鑒定及其單克隆抗體的研制.pdf

1、目的：本研究擬分別從寧夏地區(qū)疑似犬瘟熱感染病犬的糞便拭子和犬細(xì)小病毒感染病犬的糞便拭子中，分離鑒定寧夏犬瘟熱病毒(CDV)和犬細(xì)小病毒(CPV)毒株，并制備相應(yīng)的單克隆抗體，為犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病的早期快速診斷和預(yù)防治療提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：1.收集寧夏地區(qū)疑似犬瘟熱感染病犬的糞便拭子和犬細(xì)小病毒感染病犬的糞便拭子預(yù)處理后，分別接種非洲綠猴腎細(xì)胞系（Vero）和貓?zhí)ツI細(xì)胞系(FK81)進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞毒性改變（C

2、PE）。
　　2.37℃/-20℃凍融收獲分離培養(yǎng)的病毒，并對收獲的CDV、CPV分別進(jìn)行鑒定。鑒定試驗有：病毒毒力測定（TCID50）、透射電鏡觀察病毒顆粒形態(tài)、特異性PCR鑒定及間接免疫熒光試驗（IFA）檢測。
　　3.對分離培養(yǎng)鑒定出的CDV、CPV病毒分別濃縮純化后，分別免疫6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，并在二次免疫兩周后同時剪尾巴采血測小鼠體內(nèi)血清抗體效價，為細(xì)胞融合做準(zhǔn)備。同時建立間接ELISA檢測方法。

3、r>　　4.制備CDV和CPV免疫脾細(xì)胞，分別與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP20）、BALB/c小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后加入HAT培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，12天后更換為HT培養(yǎng)基。對間接ELISA檢測陽性的融合孔利用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，并隨時檢測克隆化后單克隆孔抗體分泌情況。將篩選出的間接ELISA檢測3次以上陽性的單克隆孔擴(kuò)大培養(yǎng)并保存。
　　5.將篩選出的抗CDV單克隆抗體株和抗CPV單克隆抗體株分別進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞染色體計數(shù)、單克隆

4、抗體亞型鑒、效價檢測、特性性和穩(wěn)定性檢測和單克隆抗體抗原表位分析及單克隆抗體親和層析柱純化。
　　結(jié)果：1.Vero細(xì)胞接種疑似犬瘟熱感染病料盲傳至第四代時，90％以上細(xì)胞發(fā)生CPE改變；透射電鏡從形態(tài)學(xué)方面觀察到病毒液中有形狀不規(guī)則，直徑在200nm左右，有囊膜的病毒顆粒；RT-PCR特異性鑒定和N基因全長擴(kuò)增分別在484bp和1572bp處出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的目的片段；IFA試驗在細(xì)胞胞質(zhì)中可觀察到點狀的特異性綠色熒光。

5、>　　2.FK81細(xì)胞接種疑似犬細(xì)小病感染病料盲傳至第三代時，90%以上細(xì)胞發(fā)生CPE改變；透射電鏡從形態(tài)學(xué)方面觀察到病毒液中呈現(xiàn)立體對稱、圓形、無囊膜，直徑在20～23nm之間的實心病毒顆粒；PCR特異性鑒定和VP2基因全長擴(kuò)增分別在209bp和1755bp處出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的目的片段；IFA試驗可觀察到圍繞細(xì)胞核的特異性綠色熒光。
　　3.利用間接ELISA篩選出3株抗CDV單克隆雜交瘤細(xì)胞，分別為C6細(xì)胞株、G10細(xì)胞株、

6、H2細(xì)胞株；篩選出3株抗CPV單克隆雜交瘤細(xì)胞株，分別為B8細(xì)胞株、E10細(xì)胞株、F12細(xì)胞株。
　　4.3株抗CDV單克隆雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目都在90條以上，效價較低，亞型鑒定都為IgG1型且抗原表位相同，經(jīng)鑒定為同一株單克隆雜交瘤細(xì)胞；3株抗CPV單克隆雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目都在95條以上，效價相對高，亞型鑒定B8株和F12株為IgG1型，E10株為IgM型，抗原表位不同，特異性高，穩(wěn)定性好。
　　結(jié)論：成功分離培養(yǎng)并鑒定