T7Select噬菌體展示單鏈抗體庫的構建及抗CD44v6單鏈抗體的篩選.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開： 第一章全套抗體重鏈、輕鏈的克隆 目的： 從消化道腫瘤患者外周血中分離淋巴細胞，克隆人全套抗體重鏈、輕鏈基因，并重組連接成抗體庫構建所需要的VH-linker-VL單鏈抗體基因。 方法： 在2006年10月1日至12月30日的住院病人中收集外周血：正常(2人×5ml/人)，胃癌(3人×5ml/人)，新生兒(2人×2ml/人)，結直腸癌(3人×5ml/人)，胰腺癌(

2、1人×5ml/人)。密度梯度分離人外周血淋巴細胞， RT-PCR方法擴增全套重鏈、輕鏈基因：重疊延伸PCR法構建重組VH-linker-VL單鏈抗體基因。PCR引物合成時引入Sal I、Not I酶切位點和linker連接片段(Gly4Ser)3。 結果： RT-PCR克隆得到重鏈基因產(chǎn)物長度均在400bp左右，κ輕鏈基因產(chǎn)物長度均在400bp左右，λ輕鏈基因產(chǎn)物長度均在400bp左右。重疊延伸PCR構建得到VH-lin

3、ker-VL(κ/λ)單鏈抗體基因，產(chǎn)物片段約800bp大小。 結論： 本部分實驗成功構建了VH-linker-VL(κ/λ)單鏈抗體基因，為單鏈抗體庫的成功構建提供基礎。 第二章T7Select單鏈抗體庫的構建 目的：構建F7Select單鏈抗體庫，并測定抗體庫的容量。 方法： 分別對單鏈抗體基因和T71-2b噬菌體載體DNA進行雙酶切，然后用T4連接酶把單鏈抗體基因克隆進T7載體DNA

4、，然后進行噬菌體體外包裝，構建初級抗體庫。系列倍比稀釋后鋪板，測定抗體庫庫容。初級抗體庫經(jīng)液體擴增后得次級抗體庫，再次測定單鏈抗體庫庫容。 結果： 初級抗體庫庫容為1×103，次級抗體庫庫容為4×109。 結論： 本部分實驗成功構建了T7Select單鏈抗體庫，庫容高達4×109，為篩選抗CD44v6單鏈抗體奠定了基礎。 第三章抗CD44v6單鏈抗體的篩選 目的： 篩選融合表達抗C

5、D44v6單鏈抗體的重組噬菌體，并PCR擴增目的片段，進行進一步分析鑒定。 方法： FITC免疫熒光標記觀察胃癌細胞系SGC7901 CD44v6蛋白表達情況。收集培養(yǎng)SGC7901 細胞，提取膜蛋白;然后從膜蛋白中免疫磁珠親和純化得到CD44V6蛋白。以CD44v6蛋白包被ELISA板，固相篩選抗CD44v6單鏈抗體三輪。PCR擴增第三輪篩選得到的重組噬菌體，測序，并用Ig BLAST (http：//www．ncbi

6、．nlm．nih．gov/igblas/)進行亞組分析。利用Geno3D (http：//geno3d-pbil．ibcp．fr/cgi-bin/geno3d_automat．pl?page=/GENO3D/geno3d_ho me．html)在線工具對單鏈抗體蛋白質構象進行預測。 結果： SGC7901高表達CD44v6蛋白。平板試驗顯示從第一輪篩選到第三輪篩選重組噬菌體表現(xiàn)出明顯的富集現(xiàn)象：第一輪篩選噬菌體滴度1.7

7、×108；第二輪1.3×109；第三輪2.3×1010。PCR擴增得到大小約800bp的目的條帶。測序結果顯示插入片段長度為768bp。Ig Blast序列比對顯示單鏈抗體基因由重鏈基因IgHV1(分數(shù)438比特，E值e-124)和輕鏈IgLV2(分數(shù)400比特，E值e-113)構成。Geno3D以2GKI蛋白構象為模板成功預測了單鏈抗體的三級結構。 結論： 本部分實驗成功篩選到表達抗CD44v6單鏈抗體重組噬菌體，并克