血管平滑肌細(xì)胞中AT-,1-受體偶聯(lián)蛋白質(zhì)的鑒定.pdf

1、本研究通過血管緊張素Ⅱ刺激血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)，篩選血管緊張素Ⅱ 1型受體(AT<,1>受體)相互偶聯(lián)的蛋白質(zhì)，以發(fā)現(xiàn)新的AT<,1>受體偶聯(lián)蛋白質(zhì)；同時(shí)觀察有無血管緊張素Ⅱ刺激的VSMC中AT<,1>受體偶聯(lián)蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，探討影響AT<,1>受體介導(dǎo)的信號(hào)通路及受體調(diào)節(jié)可能的機(jī)制。 方法：將引產(chǎn)胎兒的主動(dòng)脈VSMC原代培養(yǎng)并傳至6-8代用于實(shí)驗(yàn)。按平行對(duì)照一組細(xì)胞加血管緊張素Ⅱ刺激(實(shí)驗(yàn)組)和另一組細(xì)胞不加血管緊張素

2、Ⅱ刺激(對(duì)照組)。兩組同時(shí)提取細(xì)胞總蛋白后，用免疫共沉淀及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法分離AT<,1>受體偶聯(lián)蛋白質(zhì)。從膠中切取實(shí)驗(yàn)組顯色的蛋白質(zhì)條帶及對(duì)照組相應(yīng)位置的凝膠，進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS／MS)分析，通過搜索數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定和比較兩組AT<,1>受體偶聯(lián)蛋白質(zhì)的異同。在此基礎(chǔ)上，采甩免疫共沉淀和Western blot分析技術(shù)對(duì)AT<,1>受體偶聯(lián)蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組分離鑒定了14個(gè)

3、AT<,1>受體偶聯(lián)蛋白質(zhì)。分別是2個(gè)波形蛋白；角蛋白25A；肌動(dòng)蛋白γ-1和5個(gè)類肌動(dòng)蛋白；異三聚體G蛋白成員中的2個(gè)Gq／11α亞單位；ADP／ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；AT<,1>受體相關(guān)蛋白(Type-1 angiotensin Ⅱ receptor-associated protein，ATRAP)及硫氧還蛋白。進(jìn)一步Western blot技術(shù)驗(yàn)證了鑒定蛋白質(zhì)中硫氧還蛋白在血管緊張素Ⅱ刺激后與AT<,1>受體相偶聯(lián)。而對(duì)照組只鑒定出其

4、中的6個(gè)AT<,1>受體偶聯(lián)蛋白質(zhì)：2個(gè)波形蛋白、角蛋白25A、2個(gè)Gq／11 α亞單位和ATRAP。本實(shí)驗(yàn)分離鑒定的波形蛋白、角蛋白25A、肌動(dòng)蛋白、類肌動(dòng)蛋白、ADP／ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和硫氧還蛋白是文獻(xiàn)尚未報(bào)道的新的AT<,1>受體偶聯(lián)蛋白。 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)組分離鑒定出14個(gè)AT<,1>受體偶聯(lián)蛋白，其中波形蛋 白、角蛋白25A、肌動(dòng)蛋白、類肌動(dòng)蛋白、ADP／ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和硫 氧還蛋白是文獻(xiàn)尚未報(bào)道的新的AT<,1>受體偶聯(lián)