轉(zhuǎn)染Noggin基因的骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的初步研究.pdf

1、[目的] 腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，其致殘率和病死率均很高。腦卒中治療的關(guān)鍵是重建神經(jīng)通路，重建神經(jīng)通路的前提是有新生神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生。成年哺乳動物腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，給腦卒中的治療帶來了新的曙光。但神經(jīng)干細(xì)胞的組織來源一直是這一研究領(lǐng)域最棘手的問題。 骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal celIs,BMSC)，是存在于骨髓基質(zhì)中一種成體干細(xì)胞，來源于中胚層，具有很強(qiáng)的自我增殖和多向分化能

2、力，可以分化為多種不同的組織細(xì)胞，是組織工程學(xué)研究中的一種理想種子細(xì)胞。目前國內(nèi)外研究報道骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)外可被誘導(dǎo)分化神經(jīng)細(xì)胞，如骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以被化學(xué)物質(zhì)如視黃酸、β-巰基乙醇，中藥如黃芩甙、天麻等誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞。但是利用胚胎發(fā)育過程中的神經(jīng)誘導(dǎo)蛋白--Noggin蛋白對骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究在國內(nèi)尚屬空白。 Noggin基因是1992年California大學(xué)的Harland，R．M．和Smith，W．C．從非

3、洲爪蟾的胚胎中分離出來的，在胚胎發(fā)育中有重要神經(jīng)誘導(dǎo)作用，尤其是誘導(dǎo)外胚層的背側(cè)發(fā)育<'[1]>。作為一種內(nèi)源性神經(jīng)誘導(dǎo)信號，它的作用不僅局限于胚胎期，在成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)也可檢測到noggin基因的表達(dá)。另外它還參與其他組織的發(fā)育過程，如心臟中隔的形成和關(guān)節(jié)軟骨的形成。 因此，本研究擬通過克隆并構(gòu)建一個Noggin基因的表達(dá)載體，初步探討轉(zhuǎn)染Noggin基因的骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外分化為神經(jīng)細(xì)胞的情況，為下一步進(jìn)行骨髓基質(zhì)細(xì)

4、胞的神經(jīng)移植或基因治療打下基礎(chǔ)。 [方法] 1．用Percoll淋巴細(xì)胞分離液分離出大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，并用含20％(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，胰酶消化傳代，擴(kuò)增大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞。 2．應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，從正常人胎腦組織中擴(kuò)增出Noggin基因，利用基因工程技術(shù)將其與質(zhì)粒pCS2+[Ta1]-GFP連接，構(gòu)建載體pCS2+[Tαl]-Noggin。經(jīng)酶切、PCR、DNA序列

5、分析鑒定確定載體構(gòu)建無誤。 3．取第四代、第六代BMSC，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)Noggin基因進(jìn)入到骨髓基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，并利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)鑒定分化細(xì)胞是否表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記：物神經(jīng)細(xì)胞特異性烯醇化酶(NSE)、微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)以及星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。 [結(jié)果] 1．大鼠BMSC的分離培養(yǎng)用Percoll淋巴細(xì)胞分離液對大鼠骨髓作密度梯度離心

6、，所得細(xì)胞為比較均一的球形單個核細(xì)胞，臺盼蘭染色細(xì)胞活力達(dá)99％。接種培養(yǎng)10-14天后，細(xì)胞貼滿培養(yǎng)瓶瓶底，進(jìn)行細(xì)胞的首次傳代。傳3-4代后，可以形成較典型的BMSC，細(xì)胞大而扁，呈梭形、三角形、多角形，折光性差，立體感不強(qiáng)。 2．從正常人胎腦組織中克隆出的noggin cDNA片段經(jīng)測序鑒定，克隆基因序列與GenBank收錄人noggin cDNA序列(基因存取號NM_005450)完全同源。并以此成功構(gòu)建Noggin基