BMP-2基因轉(zhuǎn)染ADSCs復(fù)合CTCP成骨及修復(fù)頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 1、探索SD大鼠脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞(adiposederivedstemcells,ADSCs)的體外培養(yǎng)方法，觀察其體外增殖能力及生物學(xué)特性，對(duì)細(xì)胞表面干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志進(jìn)行鑒定，為脂肪干細(xì)胞的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。 2、對(duì)原代及第3代ADSCs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞定向誘導(dǎo)，觀察其多向分化潛能，并探討其體外成骨能力，為ADSCs作為骨組織工程種子細(xì)胞提供理論依據(jù)。 3、擴(kuò)增、純化本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的含重

2、組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(humanbonemorphogeneticprotein,hBMP-2)基因和含綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)基因的重組腺病毒表達(dá)載體(Ad-hBMP-2，Ad-GFP)，并測(cè)定其滴度；研究ADSCs經(jīng)基因轉(zhuǎn)染后生物學(xué)行為的變化和目的基因的表達(dá)，應(yīng)用Ad-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞，測(cè)定腺病毒轉(zhuǎn)染效率。 4、探索以Ad-BMP-2轉(zhuǎn)染的ADSCs作種子細(xì)胞，并以殼聚糖—磷酸三

3、鈣(CTCP)為支架材料，構(gòu)建組織工程化骨的可行性，觀察在無(wú)免疫力的裸鼠體內(nèi)成骨情況，和在有免疫力的SD大鼠體內(nèi)修復(fù)下頜骨缺損的效果。 方法 1、從3周齡SD大鼠腹股溝脂肪墊分離出脂肪組織，通過(guò)Ⅰ型膠原酶消化法獲取原代ADSCs，適時(shí)傳代。逐日倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特征;研究其增殖過(guò)程，MTT法繪制出生長(zhǎng)曲線；采用免疫組化、免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表面干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志進(jìn)行鑒定。應(yīng)用透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。 2

4、、對(duì)原代及第3代ADSCs向成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞分別應(yīng)用成脂肪誘導(dǎo)液，成骨誘導(dǎo)液，成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)液定向誘導(dǎo)，觀察其多向分化潛能。并分進(jìn)行油紅O染色，PPARr免疫組化染色進(jìn)行脂肪細(xì)胞鑒定；應(yīng)用堿性磷酸酶染色、OC/Ⅰ型膠原免疫組化、VonKossa染色鑒定成骨特性。應(yīng)用NSE/GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定成神經(jīng)細(xì)胞情況。 3、將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的Ad-BMP-2/Ad-GFP用人胚腎細(xì)胞(HEK293細(xì)胞)擴(kuò)增、純化并進(jìn)

5、行滴度測(cè)定；通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、透射電鏡觀察，生長(zhǎng)曲線的測(cè)定、堿性磷酸酶染色、體外礦化實(shí)驗(yàn)和RT-PCR、Western-blotting檢測(cè)，觀察脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad-hBMP-2后生物學(xué)行為的變化和目的基因hBMP-2的表達(dá)。ADSCs轉(zhuǎn)染Ad-GFP后12h，應(yīng)用熒光顯微鏡觀測(cè)，測(cè)定腺病毒轉(zhuǎn)染效率，并觀測(cè)轉(zhuǎn)染Ad-GFP的ADSCs傳代后綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。 4、轉(zhuǎn)染目的基因的ADSCs與未轉(zhuǎn)染的ADSCs對(duì)照組細(xì)

6、胞分別以5×107cell/mL的密度與CTCP支架材料復(fù)合，構(gòu)建組織工程化骨，體外進(jìn)行掃描電鏡觀察，確定支架的組織相容性。植入裸鼠體內(nèi)，6周后進(jìn)行組織學(xué)新骨成骨面積分析。 將20只成年SD大白鼠，隨機(jī)分為4組，前3組為治療組，每組6只，于一側(cè)下頜骨體部制造5mm×5mm的全厚下頜骨缺損模型，分別植入A組：hBMP-2基因修飾的組織工程化骨；B組：未經(jīng)基因修飾的組織工程化骨和C組單純CTCP材料，D組2只，未植入任何材料作為空白

7、對(duì)照。分別于術(shù)后第4周、第12周各處死一半實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，獲取標(biāo)本并行大體觀察、X線檢查、組織學(xué)檢查、免疫組化測(cè)試，并應(yīng)用單因素方差分析對(duì)各組不同時(shí)期的新生骨量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。 結(jié)果 1、從大鼠脂肪組織中分離培養(yǎng)出ADSCs，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，具有良好的體外增殖能力，且長(zhǎng)期傳代仍能保持穩(wěn)定的增殖力。免疫組化及流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示：培養(yǎng)第3代脂肪干細(xì)胞CD13、CD44表達(dá)率維持較高水平，而不表達(dá)CD34、CD106和HLA-

8、DR。 2、原代及第3代ADSCs體外均能定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞表型的細(xì)胞。ADSCs在成骨誘導(dǎo)7d、14d堿性磷酸酶染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，VonKossa染色出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，OC、Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性，表現(xiàn)成骨細(xì)胞特性。成脂誘導(dǎo)14d細(xì)胞體積變大，胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪滴，油紅O染色紅色表達(dá)，PPARr免疫組化染色核內(nèi)有黃色顆粒；成神經(jīng)誘導(dǎo)5h后，免疫組化染色NSE陽(yáng)性表達(dá)，GFAP陰性表達(dá)。 3、體外轉(zhuǎn)染ADS

9、Cs后發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變；生長(zhǎng)曲線表明ADSCs轉(zhuǎn)染Ad-hBMP-2后增殖能力未見明顯降低；透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器變豐富；堿性磷酸酶染色見大部細(xì)胞呈現(xiàn)陽(yáng)性，著色以細(xì)胞核為中心沿細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布；經(jīng)VonKossa染色見有黑色的礦化結(jié)節(jié)；RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后24h即有mRNA表達(dá)、2周明顯、4周仍有表達(dá)；轉(zhuǎn)染后第3天、2周、4周，上清液Western-blotting檢測(cè)可測(cè)到陽(yáng)性蛋白電泳帶。Ad-GFP

10、轉(zhuǎn)染12小時(shí)后即可檢測(cè)到綠色熒光蛋白表達(dá)；轉(zhuǎn)染2天后平均轉(zhuǎn)染效率為95﹪，傳至5代后依然可檢測(cè)到綠色熒光蛋白表達(dá)。 4、ADSCs可以在CTCP支架網(wǎng)孔內(nèi)表面貼壁生長(zhǎng)，組織相容性好，光鏡和掃描電鏡下均能發(fā)現(xiàn)支架材料爬滿細(xì)胞。 裸鼠體內(nèi)的背部皮下和大腿肌肉內(nèi)內(nèi)植入6周后，轉(zhuǎn)基因組復(fù)合材料體積包滿，質(zhì)地較硬；而另兩組體積變小，質(zhì)地較軟。轉(zhuǎn)基因組X線檢查明顯的骨組織影；另兩組則不明顯。組織病理示基因修飾的實(shí)驗(yàn)組新骨形成的面積大

11、于對(duì)照組(P＜0.05)。基因修飾組病理免疫組化可檢測(cè)到BMP-2陽(yáng)性表達(dá)。 SD大白鼠下頜骨缺損的修復(fù)結(jié)果： X線檢查：術(shù)后4周A組骨缺損區(qū)域可見有呈絮狀或條索狀密度增高影；B、C組缺損區(qū)亦有云霧狀高密度影；D組骨缺損區(qū)界線清楚，未見高密度影。術(shù)后12周，A組缺損處密度與周圍骨質(zhì)基本相似；B、C組缺損處密度略低于周圍骨組織；C組仍有約3mm左右的矩形缺損。 組織學(xué)檢查：4周時(shí)，A組間隙內(nèi)有大量骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及

12、類骨質(zhì)。B、C組有較少量骨細(xì)胞及骨樣組織形成；D組缺損處見肌肉和纖維結(jié)締組織。成骨面積分析A組大于B、C兩組(P＜0.05)；B、C兩組之間無(wú)顯著差異。12周時(shí)，A組材料大部降解，其間新生骨、軟骨樣組織更為明顯;B、C組見較多新骨組織形成，但骨密度低；D組缺損處依然見肌肉和纖維結(jié)締組織，空白組缺損未能修復(fù)。 結(jié)論 1、大鼠脂肪組織中含有大量ADSCs，且易于分離培養(yǎng)，體外擴(kuò)增迅速，長(zhǎng)期傳代仍能保持穩(wěn)定的增殖力。

13、2、ADSCs具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多向分化潛能，有可能作為多種組織工程的種子細(xì)胞。 3、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)：我們所構(gòu)建擴(kuò)增并純化的腺病毒載體可高效感染脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞，感染后細(xì)胞依然保持較旺盛的增殖能力，成骨能力明顯。且能夠成功地持續(xù)表達(dá)分泌型hBMP-2，為后續(xù)hBMP-2基因治療的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。 4、采用二次冷凍干燥法制成的殼聚糖-磷酸三鈣(CTCP)復(fù)合材料具有適宜的三維多孔結(jié)構(gòu)，脂肪基質(zhì)干細(xì)胞