攜帶重組人胰島素基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：1.探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stemcells hUCMSCs)體外分離、培養(yǎng)、純化條件，并對(duì)hUCMSCs的生物學(xué)特性進(jìn)行研究；2.構(gòu)建含人重組胰島素(insulin)與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP，并進(jìn)行慢病毒顆粒的包裝，純化，濃縮及滴度測(cè)定；3.以GFP作為報(bào)告基因，篩選慢病毒轉(zhuǎn)染人臍帶

2、間充質(zhì)干細(xì)胞最適MOI值，為進(jìn)一步進(jìn)行攜帶外源基因的轉(zhuǎn)染探索條件；4.研究攜帶重組人胰島素慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后，基因及蛋白水平的表達(dá)情況，為進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)回植提供研究基礎(chǔ)。
　　 方法：1.將剔除動(dòng)脈和靜脈的新鮮人臍帶組織剪成小塊培養(yǎng)(1mm×lmm×lmm)，培養(yǎng)1-2周后得到貼壁細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志；化學(xué)染色檢測(cè)體外誘導(dǎo)成脂和成骨分化的能力

3、；2.應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增獲得insulin基因序列，在目的基因上游加上BamHI，下游加上AscI兩個(gè)酶切位點(diǎn)；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行T載體克隆，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5α細(xì)胞中，通過篩選獲得重組質(zhì)粒pMDl8T-insulin，測(cè)序分析選定序列正確的克隆提取質(zhì)粒；用限制性內(nèi)切酶分別酶切pMDl8T-insulin和pLenti6.3-IRES-EGFP質(zhì)粒，將insulin基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP載體連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH

4、5α細(xì)胞中，通過篩選獲得慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP，并進(jìn)行測(cè)序。中量抽提慢病毒載體，將慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝病毒，純化及濃縮并測(cè)定病毒滴度。3.以EGEP作為報(bào)告基因，分別以MOI值0，1，3，5，7，10，15，20轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察48小時(shí)，72小時(shí)，96小時(shí)，熒光表達(dá)情況，篩選慢病毒轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞最適轉(zhuǎn)染時(shí)間及MOI值；4.轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用qPCR及RT-PC

5、R方法檢測(cè)重組人胰島素基因表達(dá)情況，應(yīng)用westen bloting方法檢測(cè)胰島素蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：l.體外培養(yǎng)一周，細(xì)胞從組織塊中爬出；細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第10代，無明顯形態(tài)及增值能力改變；細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD44，CDl06，而CD34，HLA-DR表達(dá)陰性。體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hUCMSCs具有成脂及成骨分化的能力。2.聚合酶鏈反應(yīng)獲得長(zhǎng)度347bp帶有BamHI和AscI兩個(gè)酶切位點(diǎn)序列的目的基因，經(jīng)與克隆載體pMDl8

6、-T載體和慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-IRES-EGFP連接，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP。成功包裝病毒，純化及濃縮并測(cè)定病毒滴度。3.重組慢病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)值是10時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高可達(dá)到90％。應(yīng)用qPCR及RT-PCR方法檢測(cè)重組人胰島素基因表達(dá)情況，證實(shí)基因水平的表達(dá)量，轉(zhuǎn)染組為陽(yáng)性，未轉(zhuǎn)染組為陰性。應(yīng)用westen bloting方法檢測(cè)胰島素蛋白