表達(dá)Harpin蛋白的枯草芽孢桿菌生防菌的構(gòu)建.pdf

1、生物防治是植物病害綜合治理體系中的一個(gè)重要組成部分，植物同病原菌互作的進(jìn)化過程中形成的過敏反應(yīng)是自然界中植物抵抗病原菌侵染的最有效方式。Harpin是一類植物病原細(xì)菌分泌的蛋白質(zhì)，能誘導(dǎo)非寄主植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)，這種防衛(wèi)反應(yīng)的產(chǎn)生，可以抵抗多種多樣的病原物對(duì)植物的第二次侵染，類似于人或動(dòng)物的免疫系統(tǒng)?？莶菅挎邨U菌本身無毒，對(duì)多種植物病原菌具有拮抗作用，是一種天然的植病生防菌。利用Harpin的誘導(dǎo)抗病性和生防菌的拮抗作用開發(fā)新型的生物農(nóng)藥

2、具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)將利用枯草芽孢桿菌來表達(dá)Harpin蛋白，期望獲得一種既能誘導(dǎo)植物抗性又能與植物病原菌競(jìng)爭(zhēng)、拮抗的多功能生防菌。
　　為了能使Harpin蛋白分泌到培養(yǎng)基中，與植物細(xì)胞直接作用，誘導(dǎo)植物的防衛(wèi)反應(yīng)。首先，我們以枯草芽孢桿菌168總DNA為模板擴(kuò)增組成型強(qiáng)啟動(dòng)子P43和分泌效率較高的nprB信號(hào)肽，通過重組PCR連接兩片段，克隆至大腸桿菌和芽孢桿菌的穿梭載體pUBC19，構(gòu)建組成型表達(dá)分泌載體pU

3、BC-PS。
　　其次，以新鮮制備的胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)Se9總DNA為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增hrpNECC9基因，PCR產(chǎn)物克隆于表達(dá)載體pUBC-PS，獲得重組質(zhì)粒pUBC-PSh2，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子-DH5α(pUBC-PSh2)。小量提取pUBC-PSh2質(zhì)粒，采用堿金屬轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入缺失

4、8種蛋白酶基因的枯草桿菌WB800，在含有卡那霉素20μg/mL的LB平板上篩選工程菌，對(duì)其酶切、PCR驗(yàn)證結(jié)果表明:生防工程菌WB800(pUBC-PSh2)構(gòu)建成功。
　　SDS-PAGE分析表明:工程菌培養(yǎng)到72 h時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物Harpin蛋白被分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中，表達(dá)量約占菌體蛋白總量的15％。由此證明，工程菌中的hrpNECC9基因在枯草桿菌P43啟動(dòng)子和nprB信號(hào)肽元件的帶動(dòng)下，不需誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，并且，表達(dá)產(chǎn)物被