還原型谷胱甘肽在登革病毒增殖中的作用研究.pdf

1、登革病毒(dengue virus,DV)是黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒,根據(jù)E蛋白抗原性的不同,分為四個(gè)血清型(DV1-4)。廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū),主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播。其基因組只有一個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF),編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白和七種非結(jié)構(gòu)蛋白,從5'端到3'端依次為5'-C-prM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3'。DV感染可引起人類登革

2、熱(classical dengue fever,DF)和登革出血熱/登革休克綜合征(dengue hemorrhagicfever/dengue shock syndrome,DHF/DSS)。近年來,隨著地球溫暖化和流動(dòng)人口的增加,DF和DHF/DSS流行、暴發(fā)越來越頻繁,流行區(qū)域也在不斷擴(kuò)大,登革病毒感染已是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。但到目前為止,尚無(wú)安全有效的疫苗和特效藥用于DV感染的防治。
　　 病毒由于缺乏能量代謝系統(tǒng)和必

3、要的酶類而不能獨(dú)立生存,嚴(yán)格依賴于宿主細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞后病毒利用細(xì)胞的合成代謝系統(tǒng)進(jìn)行大分子合成,因而擾亂了宿主細(xì)胞的自身代謝和生理功能,導(dǎo)致細(xì)胞的氧化還原平衡被打破,處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。新近研究表明細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)(redox state)參與病毒復(fù)制和致病過程。細(xì)胞通過產(chǎn)生谷胱苷肽(GSH),超氧化物歧化酶(SOD),硫氧還蛋白,觸酶等抗氧化分子,保持它的還原狀態(tài)。其中含三個(gè)半胱氨酸的GSH在真核細(xì)胞抗氧化方面最為重要。GSH是細(xì)胞內(nèi)

4、最主要的抗氧化物質(zhì)之一。它是細(xì)胞內(nèi)一種含毓基的小分子抗氧化劑,是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸組成的天然小分子三肽,是體內(nèi)重要的氧化還原緩沖系統(tǒng),維持機(jī)體的氧化-抗氧化平衡。GSH水平的下降有利于病毒的復(fù)制,同時(shí)影響宿主的防御反應(yīng)等。
　　 研究表明許多病毒感染引起宿主細(xì)胞氧化應(yīng)激,病毒可通過增加細(xì)胞內(nèi)氧自由基,使細(xì)胞內(nèi)GSH減少。包括1型單純皰疹病毒、仙臺(tái)病毒、HIV、流感病毒、丙型肝炎病毒等。在病毒與宿主細(xì)胞相互作用過程中,病毒

5、感染所致的細(xì)胞促氧化狀態(tài)可能觸發(fā)了某些轉(zhuǎn)錄因子,如核因子κB(NF-κB),進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞過度增殖等病理過程。NF-κB是一個(gè)氧化應(yīng)激敏感的轉(zhuǎn)錄因子,能與多種細(xì)胞基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列特定位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和表達(dá),與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答以及細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的病理生理過程密切相關(guān)。作為一個(gè)常見的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,氧化應(yīng)激反應(yīng)途徑可以激活NF-κB信號(hào)通路。細(xì)胞內(nèi)巰基在調(diào)節(jié)NF-κB活化方面起重要作用。低水平巰基促進(jìn)

6、NF-κB的活化;高水平巰基抑制NF-κB的活化。目前關(guān)于DV感染引起宿主細(xì)胞氧化還原狀態(tài)改變的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,DV可以直接感染肝細(xì)胞,引起肝臟損傷,換言之,肝臟可能是DV重要的靶器官之一。最近臨床研究發(fā)現(xiàn)登革熱病人體內(nèi)出現(xiàn)氧化損傷。因此,本研究通過研究DV感染過程中GSH的變化及其作用,初步探討DV2感染與細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的關(guān)系。期望本研究結(jié)果為深入闡明DHF/DSS的發(fā)病機(jī)制及防治措施提供理論依據(jù)。

7、
　　 本研究主要結(jié)果與結(jié)論如下:
　　 1.DV2感染對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)外GSH水平的影響
　　 為了研究DV2感染對(duì)細(xì)胞GSH水平的影響,我們檢測(cè)了DV2感染后,不同時(shí)相點(diǎn)HepG2細(xì)胞內(nèi)外的GSH的水平。以DV2(MOI=10)感染HepG2細(xì)胞,模擬感染組則加入56℃滅活30min的病毒液,同等條件置于37℃,以病毒吸附起始記為感染0時(shí),在感染10min、20min、30min、40min、60min/1

8、h、2h、6h、12h、24h、48h(后5個(gè)時(shí)相點(diǎn)吸附后1h,更換病毒維持液)的時(shí)相點(diǎn),分別用PBS充分洗滌細(xì)胞,胰蛋白酶消化,取出細(xì)胞。經(jīng)過四次快速凍融,離心取上清用于GSH的測(cè)定。取相同數(shù)量的細(xì)胞經(jīng)超聲裂解,用于測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DV2感染導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH水平的降低。與模擬感染組比較,病毒感染后10min、20min、30min、40min、60min/1h,HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH水平呈下降趨勢(shì),其中以30min

9、下降最為顯著,為16.82±0.86nmol/mg,與模擬感染組的23.14±1.41nmol/mg和感染組的其他時(shí)相點(diǎn)比較,均有顯著差異(P＜0.01)。在病毒吸附期結(jié)束(感染1h)時(shí),GSH水平有所提高,但依然低于模擬感染組。病毒感染后2h、6h、12h、24h、48h,HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH水平仍呈下降趨勢(shì),其中以2h、24h下降較為明顯,分別為29.51±3.16 nmol/mg和17.75±3.32 nmol/mg,與相應(yīng)時(shí)相

10、點(diǎn)的模擬感染組35.45±3.55 nmol/mg和22.91±4.15 nmol/mg以及感染組的其它時(shí)相點(diǎn)比較,差異顯著(P＜0.05),其后逐漸恢復(fù),48h時(shí)已接近模擬感染組水平,二者無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 感染后30min上清中的GSH含量為47.86±3.00 nmol/ml(n=4),較模擬感染組升高33.09％,且有顯著差異(P＜0.05),而模擬感染組與病毒原液則無(wú)顯著差異(P＞0.05)。感染24h

11、,感染組與模擬感染組細(xì)胞外GSH水平?jīng)]有顯著差異(P＞0.05)。以上結(jié)果說明DV2感染能夠使HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH水平下降,改變宿主細(xì)胞的氧化還原狀態(tài),且呈現(xiàn)階段性變化。
　　 2.DV2 E、NS3蛋白對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)外GSH水平的影響
　　 以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DV2感染可影響細(xì)胞內(nèi)外GSH的水平,由此推測(cè)病毒蛋白可能參與了這一過程。為證實(shí)這一推測(cè),我們首先構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)E、NS3蛋白的HepG2細(xì)胞株pRe-E/HepG2

12、、pRe-NS3/HepG2,通過問接免疫熒光法和western blot進(jìn)行了鑒定和檢測(cè),確認(rèn)了細(xì)胞中E、NS3蛋白的表達(dá)。同時(shí)構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和能表達(dá)綠色熒光蛋白的的細(xì)胞株pRe/HepG2、pCI-GFP/HepG2作為對(duì)照。
　　 在此基礎(chǔ)上,我們測(cè)定了pRe-E/HepG2、pRe-NS3/HepG2以及pRe/HepG2、pCI-GFP/HepG2細(xì)胞內(nèi)外GSH的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與pRe/HepG2細(xì)胞對(duì)照組比較

13、,pRe-E/HepG2和pRe-NS3/HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH水平均呈下降趨勢(shì),分別為對(duì)照細(xì)胞的79％和77％,而表達(dá)GFP蛋白的pCI-GFP/HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH與pRe/HepG2細(xì)胞比較無(wú)明顯變化。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的培養(yǎng)上清0.5ml測(cè)定GSH濃度,發(fā)現(xiàn)pRe-E/HepG2、pRe-NS3/HepG2細(xì)胞外GSH分別為對(duì)照細(xì)胞的64％和65％,兩者差異顯著(P＜0.05)。以上結(jié)果表明,穩(wěn)定表達(dá)E、NS3蛋白細(xì)胞內(nèi)外GSH

14、濃度均下降顯著,提示E、NS3蛋白在宿主細(xì)胞中的表達(dá)不僅可以改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài),還可以使宿主細(xì)胞外的GSH水平降低,在DV2感染誘使的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)改變的過程中,可能起重要作用。
　　 3.GSH處理對(duì)DV2感染的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)首先通過MTT實(shí)驗(yàn)和形態(tài)學(xué)觀察,確定了外源性GSH的工作濃度為10mM和20mM。
　　 為證實(shí)GSH對(duì)病毒增殖的影響,我們首先確認(rèn)了向培養(yǎng)上清中分別加入10mM、20mM G

15、SH溶液對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSH含量無(wú)明顯影響,與空白對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P＞0.05);在此基礎(chǔ)上,實(shí)施DV2感染+GSH處理實(shí)驗(yàn),從感染起始到感染24h維持上清內(nèi)GSH濃度分別為10mM、20mM,空白對(duì)照組不加藥物處理。感染后24h收取培養(yǎng)上清,測(cè)定病毒滴度(PFU/ml)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):GSH處理可使細(xì)胞培養(yǎng)上清病毒滴度下降,并呈現(xiàn)劑量依賴特點(diǎn),10mM與20mM GSH處理組病毒滴度分別下降為對(duì)照組的62％和40％(n=5),兩種濃度G

16、SH處理組均與空白對(duì)照組差異顯著(P＜0.05),且20mMGSH處理組病毒滴度下降更為明顯(P＜0.05);以上結(jié)果說明不僅DV2可以引起細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)改變,細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)反過來也可以影響DV2的增殖。
　　 4.BSO處理對(duì)DV2感染的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)首先通過MTT實(shí)驗(yàn)和形態(tài)學(xué)觀察,確定了BSO的工作濃度為0.2mM和1mM。
　　 為進(jìn)一步證實(shí)GSH與病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖情況,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中用BSO

17、處理細(xì)胞,一種抑制GSH合成的化合物,觀察在低水平GSH情況下,DV2的增殖情況。在不感染病毒的情況下,培養(yǎng)上清中加入0.2mM、1mM BSO處理18h,細(xì)胞內(nèi)GSH含量是空白對(duì)照組的58％,但是兩種濃度下降幅度無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 5.DV感染以及E、Ns3蛋白導(dǎo)致NF-κB轉(zhuǎn)錄活性增加
　　 綜上所述,DV2感染和登革病毒蛋白E及NS3表達(dá)可使細(xì)胞內(nèi)GSH濃度降低,導(dǎo)致NF-κB活性增加和目標(biāo)基因的表