華支睪吸蟲SERPIN基因的克隆表達(dá)及其功能的初步研究.pdf

1、華支睪吸蟲病(clonorchiasis)，亦稱肝吸蟲病，是由華支睪吸蟲(Clonorchissinensis，C. sinensis)感染引起的一種食源性人獸共患寄生蟲病。該病主要流行于中國、日本、韓國、越南及其它東南亞國家，全世界有將近3,500萬人感染，我國是最主要的流行區(qū)，感染人數(shù)約為1,249萬。流行區(qū)的居民生食或食入未煮熟的含有華支睪吸蟲活囊蚴的魚、蝦而感染，反復(fù)感染可使病情加重，導(dǎo)致膽囊炎、膽管炎、膽結(jié)石、肝纖維化甚至肝膽

2、管癌。
　　 近年來，華支睪吸蟲感染率呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)，衛(wèi)生部2001-2004年進(jìn)行的全國(除臺(tái)灣、香港、澳門外)人體重要寄生蟲病流行現(xiàn)狀調(diào)查結(jié)果顯示，全國華支睪吸蟲感染率平均達(dá)0.58％，流行區(qū)華支睪吸蟲感染率為2.04％，與1990年的調(diào)查相比，感染率上升了75％。其原因主要有：改變流行區(qū)居民的飲食習(xí)慣十分困難；追求新鮮、生食或半生食魚蝦等成為新的飲食時(shí)尚；華支睪吸蟲保蟲宿主(貓、犬、鼠及其它野生動(dòng)物)的不可控性等。由于魚是

3、肝吸蟲最重要的中間宿主，因此防止魚感染肝吸蟲將對(duì)阻斷該病的傳播起到事半功倍的作用。但目前關(guān)于尾蚴如何侵入魚體或者在魚體內(nèi)形成囊壁的機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。
　　 已有研究表明，絲氨酸蛋白酶在寄生原蟲成囊過程中發(fā)揮著重要作用，其抑制劑可以顯著降低成囊率，卡氏棘阿米巴的成囊和脫囊都與絲氨酸蛋白酶的作用密切相關(guān)。而絲氨酸蛋白酶作用的發(fā)揮必須受到其抑制劑的精確調(diào)控。事實(shí)上，許多研究已經(jīng)表明寄生蟲的絲氨酸蛋白酶抑制劑可以抑制宿主的絲氨酸蛋白

4、酶，在抵抗宿主的免疫中發(fā)揮重要作用，如：馬來布魯線蟲微絲蚴的絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制人體中性粒細(xì)胞中的絲氨酸蛋白酶；曼氏血吸蟲和埃及血吸蟲的絲氨酸蛋白酶抑制劑在維持自身的生理穩(wěn)定及與宿主的相互作用中發(fā)揮雙重作用。
　　 目前關(guān)于華支睪吸蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究，除了genebank中有一條登錄的序列外未見其它報(bào)道。那么，華支睪吸蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑是否也是成囊相關(guān)分子?成為我們迫切需要解決的問題。
　　 因此，本研究從華

5、支睪吸蟲囊蚴cDNA文庫中識(shí)別華支睪吸蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑基因(將其縮寫為CsSERPIN)基因，研究免疫學(xué)特性、生物學(xué)活性、階段性表達(dá)及組織定位，為研究囊蚴的成囊機(jī)制及研制魚用疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 1、研究目的：
　　 從華支睪吸蟲囊蚴cDNA文庫中識(shí)別華支睪吸蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑基因(將其縮寫為CsSERPIN)，獲得編碼序列(CDS)，表達(dá)重組CsSERPIN蛋白(縮寫為rCsSERPIN)并對(duì)其免疫學(xué)特性及生物學(xué)

6、活性進(jìn)行評(píng)價(jià)；比較該基因在華支睪吸蟲成蟲和囊蚴階段mRNA和蛋白水平上的表達(dá)差異以及在蟲體的定位，為研究囊蚴的成囊機(jī)制及研制魚用疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 2、研究方法：
　　 2.1 CsSERPIN基因的識(shí)別及全長序列的獲得
　　 對(duì)本室構(gòu)建的華支睪吸蟲囊蚴全長cDNA質(zhì)粒文庫的表達(dá)序列標(biāo)簽測(cè)序后進(jìn)行UniGene歸并，獲得大批序列。通過BLASTx比對(duì)獲得編碼CsSERPIN蛋白的質(zhì)粒文庫的克隆號(hào)。將這些質(zhì)粒導(dǎo)入

7、大腸桿菌(E.coli)DH5α進(jìn)行擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒walking測(cè)序并進(jìn)行序列拼接，BLASTx比對(duì)后確定全長序列。使用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)CsSERPIN蛋白的分子量、穩(wěn)定性、功能域及高級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)。
　　 2.2基因的克隆表達(dá)和重組蛋白的純化
　　 根據(jù)目的基因的CDS和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以比對(duì)后確定編碼CsSERPIN的文庫質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增CsSERPIN，定向克隆該序列到

8、質(zhì)粒pET-28a(+)，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-CsSERPIN轉(zhuǎn)化E.coli BL21/DE并誘導(dǎo)表達(dá)后，Ni-IDA柱親和層析獲得純化的rCsSERPIN，用小鼠His單抗對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行Western blotting鑒定。
　　 2.3 rCsSERPIN的生物學(xué)特性和功能初步探討
　　 將純化的rCsSERPIN免疫大鼠獲得免疫血清，Wester

9、n blotting觀察免疫血清及感染華支睪吸蟲的人和大鼠血清對(duì)相應(yīng)的rCsSERPIN的識(shí)別能力，鑒定rCsSERPIN的免疫反應(yīng)性。將rCsSERPIN行含明膠的SDS-PAGE后用胰蛋白酶水解，觀察其對(duì)胰蛋白酶的作用；rCsSERPIN與胰蛋白酶和囊蚴共孵育，觀察其對(duì)胰蛋白酶誘導(dǎo)的囊蚴脫囊的影響；同時(shí)通過觀察重組蛋白對(duì)囊蚴脫囊的影響。
　　 2.4 CsSERPIN在華支睪吸蟲囊蚴和成蟲階段的表達(dá)差異
　　 用Tr

10、izol法分別提取華支睪吸蟲囊蚴和成蟲的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。以β-actin為內(nèi)參，采用半定量法灰度掃描判斷該基因囊蚴和成蟲階段表達(dá)的高低，SYBR GreenⅠ嵌合熒光法行Real Time PCR確定兩階段在mRNA水平上的表達(dá)差異；以rCsSERPIN免疫大鼠獲得的血清以及感染華支睪吸蟲的大鼠血清為一抗，Western blotting鑒定CsSERPIN蛋白在囊蚴和成蟲階段的表達(dá)。
　　 2.5 CsSERP

11、IN在華支睪吸蟲囊蚴和成蟲階段的免疫定位
　　 將華支睪吸蟲囊蚴、成蟲固定后石蠟包埋切片，免疫熒光法觀察CsSERPIN在華支睪吸蟲囊蚴和成蟲階段的組織定位。一抗用上述制備的初步純化的抗rCsSERPIN的大鼠血清，二抗用熒光標(biāo)記的抗大鼠IgG抗體。熒光顯微鏡下觀察并拍照。
　　 3、研究結(jié)果：
　　 3.1 CsSERPIN基因的全長序列和生物信息學(xué)分析
　　 從華支睪吸蟲囊蚴cDNA文庫中識(shí)別出兩種絲

12、氨酸蛋白酶抑制劑的編碼基因，克隆號(hào)分別為133f12和84g02，將其暫命名為CsSERPIN1和CsSERPIN2。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，CsSERPIN1編碼區(qū)長度為1149bp，編碼382個(gè)aa殘基，CsSERPIN2的編碼區(qū)長度為1161bp，編碼386個(gè)aa殘基。CsSERPIN1和CsSERPIN2均無信號(hào)肽，均有SERPIN的功能域，但在功能域的反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)區(qū)域差異較大。CsSERPIN1無跨膜區(qū)，CsSERPIN2有跨膜

13、區(qū)，可能為膜蛋白。
　　 3.2 CsSERPIN的基因克隆和重組蛋白表達(dá)純化
　　 重組質(zhì)粒pET28a(+)-CsSERPIN1和pET28a(+)-CsSERPIN2均構(gòu)建成功，在E.coli BL21/DE中均可表達(dá)，且均有可溶性表達(dá)。兩種重組蛋白都不夠穩(wěn)定，與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。用Ni-IDA柱親和層析獲得純化得到純化蛋白，rCsSERPIN1濃度達(dá)3000μg/ml；rCsSERPIN2的濃度為800μg

14、/ml，較難純化，可能與CsSERPIN2基因存在跨膜區(qū)有關(guān)。
　　 3.3重組CsSERPIN蛋白的免疫學(xué)和生物學(xué)特性的初步研究獲得得到大鼠抗rCsSERPIN1和rCsSERPIN2的免疫血清，滴度為均在51,200以上。
　　 重組蛋白rCsSERPIN1和rCsSERPIN2均能夠很好地識(shí)別相應(yīng)的抗血清以及感染肝吸蟲的大鼠血清和患者血清。rCsSERPIN1能夠顯著抑制胰蛋白酶對(duì)明膠的水解，且能夠抑制胰蛋白酶對(duì)囊

15、蚴的脫囊壁作用。rCsSERPIN2對(duì)胰蛋白酶不具有明顯的抑制作用。
　　 3.4 CsSERPIN在華支睪吸蟲囊蚴和成蟲階段的表達(dá)差異
　　 半定量、定量PCR和Western blotting結(jié)果均顯示兩個(gè)CsSERPIN基因在囊蚴階段的表達(dá)均顯著高于成蟲階段。囊蚴階段CsSERPIN1基因的mRNA表達(dá)量為成蟲階段的3.249倍，囊蚴階段CsSERPIN2的表達(dá)水平為成蟲階段的11.314倍。
　　 3.5

16、 CsSERPIN在華支睪吸蟲囊蚴階段的免疫定位
　　 免疫熒光結(jié)果顯示，CsSERPIN1在囊蚴主要定位于口吸盤，此外在皮下實(shí)質(zhì)組織內(nèi)有彌散分布。CsSERPIN2主要分布于囊壁以內(nèi)的蟲體表層。
　　 4、研究結(jié)論：
　　 4.1測(cè)序和生物信息學(xué)分析獲得兩個(gè)華支睪吸蟲囊蚴CsSERPIN基因的全長序列，文庫克隆號(hào)分別為133 f12和84g02。
　　 4.2 rCsSERPIN1和rCsSERPIN2