TFPI-2基因在胰腺癌細(xì)胞遷徙及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中作用機(jī)制的研究.pdf

1、胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤，易侵犯神經(jīng)、血管、淋巴管，加之解剖位置深在、隱蔽及早期缺乏特異性癥狀等特點(diǎn)，故現(xiàn)有檢查很難早期發(fā)現(xiàn)。而且，胰腺癌對(duì)現(xiàn)有的放療、化療又極為不敏感，手術(shù)切除率低(僅為15-30％)、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差[1]。因此，常規(guī)治療方法對(duì)胰腺癌的治療效果很不理想，積極探索新的治療方法，抑制胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移，改善其預(yù)后已成為目前亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。得益于DNA重組技術(shù)的發(fā)展，腫瘤是基因異常持續(xù)積累結(jié)果的認(rèn)可，針對(duì)惡性腫

2、瘤所采取的生物治療技術(shù)日趨成為腫瘤治療的重要手段之一。理論上通過(guò)細(xì)胞的基因治療，糾正相應(yīng)的基因異常，可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性屬性。體外實(shí)驗(yàn)證明：將組織金屬蛋白酶抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞Panc-1后，可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞裸鼠接種的成功率、接種瘤的生長(zhǎng)、血管生成和轉(zhuǎn)移，并增加Panc-1細(xì)胞的凋亡率，并顯著延長(zhǎng)裸鼠負(fù)瘤生存期。 定位于人類染色體7q2

3、2的TFPI-2基因，其編碼產(chǎn)物組織因子途徑抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI-2)是廣譜絲氨酸蛋白酶抑制物，廣泛分布于人類肝、胰腺、腎、心、骨骼肌和前列腺等正常組織，體外可強(qiáng)烈抑制纖溶酶、胰蛋白酶，基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinases，MMP-1)和3(MMP-3)的活化[4,5]，參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的

4、重塑過(guò)程，維持ECM的結(jié)構(gòu)完整，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等一系列生理和病理過(guò)程中扮演重要角色?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)TFPI-2與多種腫瘤如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、絨毛膜癌、黑色素瘤以及肺癌等的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。 本研究構(gòu)建TFPI-2基因的真核表達(dá)載體pEGFP-C1-TFPI-2，并將其轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞系Panc-1細(xì)胞，探討轉(zhuǎn)染細(xì)胞TFPI-2基因表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及體內(nèi)和體外侵襲浸潤(rùn)能力影響及其可能的作用機(jī)制，為判斷胰

5、腺癌的預(yù)后及其基因治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的： 本研究應(yīng)用分子生物學(xué)、免疫學(xué)技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TFPI-2的人TFPI-2基因真核表達(dá)載體pEGFP-C1-TFPI-2，將其轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞系Panc-1細(xì)胞，觀察TFPI-2基因在胰腺癌細(xì)胞系Panc-1中的表達(dá)情況，測(cè)定并比較TFPI-2表達(dá)組與非表達(dá)組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，利用Boyden小室檢測(cè)TFPI-2表達(dá)組與非表達(dá)組胰腺癌細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)，比較TFPI-2表達(dá)組與

6、非表達(dá)組胰腺癌細(xì)胞的裸鼠成瘤大小，以此作為評(píng)價(jià)胰腺癌細(xì)胞體外和體內(nèi)侵襲浸潤(rùn)能力的指標(biāo)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)TFPI-2表達(dá)組與非表達(dá)組細(xì)胞凋亡率，研究TFPI-2的表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期及細(xì)胞凋亡的影響。 方法： 1.RT-PCR實(shí)驗(yàn)：目的基因的擴(kuò)增及轉(zhuǎn)染后TFPI-2mRNA檢測(cè)； 2.Western blot實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染前后TFPI-2蛋白表達(dá)的檢測(cè)； 3.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：采用脂質(zhì)體Lipofecta

7、mine2000介導(dǎo)； 4.Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)：觀察TFPI-2對(duì)胰腺癌細(xì)胞體外遷徙和浸潤(rùn)能力的影響； 5.裸鼠皮下種植瘤模型建立：觀察TFPI-2對(duì)胰腺癌細(xì)胞裸鼠成瘤的影響及體內(nèi)浸潤(rùn)能力的影響； 6.細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用DNALadder帶凝膠電泳和流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了人TFPI-2基因真核表達(dá)載體pEGFP-C1-TFPI-2； 2.Pane-1細(xì)胞無(wú)TFP

8、I-2基因表達(dá)，脂質(zhì)體Lipofectamine2000能介導(dǎo)真核表達(dá)載體pEGFP-C1-TFPI-2轉(zhuǎn)染Pane-1細(xì)胞，并使其穩(wěn)定表達(dá)TFPI-2 mRNA及相應(yīng)蛋白； 3.TFPI-2能抑制胰腺癌細(xì)胞的體外侵襲能力； 4.TFPI-2能抑制胰腺腫瘤的生長(zhǎng)及體內(nèi)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移； 5.TFPI-2能誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。 結(jié)論： TFPI-2能顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的體外、體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力，其作用可能通過(guò)