EGF-R、IGF-1-R在胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化為上皮細(xì)胞中的作用.pdf

1、目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSCs）具有多向分化潛能。課題組已有實(shí)驗(yàn)表明在加入EGF、IGF-1等生長(zhǎng)因子的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)下BMSCs能表達(dá)CK，向上皮分化。但BMSCs何時(shí)表達(dá)EGF-R和IGF-1-R以及該受體與細(xì)胞分化為上皮細(xì)胞的關(guān)系尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬測(cè)定BMSCs EGF-R和IGF-1-R的表達(dá)時(shí)間；在加入EGF或IGF-1誘導(dǎo)后BMSC

2、s表達(dá)EGF-R、IGF-1-R和CK的變化；以及加入受體阻斷劑后培養(yǎng)的BMSCs是否還能分化為上皮細(xì)胞。擬通過本實(shí)驗(yàn)研究EGF、IGF-1誘導(dǎo)BMSCs分化的機(jī)制，為BMSCs在細(xì)胞移植治療以及組織工程研究提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)方法。 第一部分胎兒BMSCs表達(dá)EGF受體和IGF受體及體外誘導(dǎo)分化 1.收集3～5個(gè)月胎齡引產(chǎn)胎兒四肢骨骨髓，分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增獲得BMSCs。比較11～13周的標(biāo)本和20～24周標(biāo)本獲得的BMS

3、Cs的生長(zhǎng)特點(diǎn)。結(jié)果：13周以內(nèi)標(biāo)本獲得的細(xì)胞擴(kuò)增到P4時(shí)，數(shù)量多于20～24周標(biāo)本；首次傳代時(shí)間早，衰老出現(xiàn)時(shí)間晚。 2.檢測(cè)BMSCs EGR-R和IGF-1R出現(xiàn)時(shí)間。從P3開始，用免疫組織化學(xué)染色法每天檢測(cè)EGF-R、IGF-1-R的表達(dá)。結(jié)果顯示：EGF-R首次表達(dá)為P4第4d～P5第3d；IGF-1-R首次表達(dá)為P5第2d～P6第2d。 3.分別用EGF30ng/mL，IGF-150 ng/mL，EGF30

4、ng/mL+IGF-150ng/mL誘導(dǎo)P3-BMSCs，設(shè)立無(wú)生長(zhǎng)因子對(duì)照組，檢測(cè)EGF-R、IGF-1-R和CK的表達(dá)。結(jié)果：EGF和IGF-1誘導(dǎo)組細(xì)胞表達(dá)EGF-R和IGF-1-R較對(duì)照組提前2～4天；CK表達(dá)最早出現(xiàn)在P4誘導(dǎo)后2天，對(duì)照組P6第4d出現(xiàn)微弱的CK表達(dá)。 4.用抗EGF-R抗體2mg/mL或抗IGF-1-R抗體1.5mg/mL孵育P5-BMSCs4h后，分別加入含EGF30ng/mL、IGF-150ng

5、/mL的培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)另設(shè)4個(gè)對(duì)照組：EGF30ng/mL，IGF-150ng/mL，EGF30ng/M1+IGF-150ng/mL和空白對(duì)照組。檢測(cè)EGF-R、IGF-1-R和CK的表達(dá)。結(jié)果：EGF-R和IGF-1-R阻滯后，第4d可檢測(cè)到CK，但CK+細(xì)胞率和強(qiáng)度均低于加入生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)組（P<0.05），接近空白對(duì)照組。 第二部分羊膜體外誘導(dǎo)胎兒BMSCs的分化 1.取10例羊膜，用機(jī)械分離和氫氧化銨法去除上皮，

6、制成羊膜結(jié)締組織，光鏡觀察其表面無(wú)上皮細(xì)胞。 2.將3.0×105個(gè)DAPI標(biāo)記的P4-BMSCs種植于羊膜上，分別用EGF30ng/mL，IGF-150ng/mL，EGF30 ng/mL+IGF-150 ng/mL聯(lián)合誘導(dǎo)，同時(shí)設(shè)無(wú)生長(zhǎng)因子的羊膜對(duì)照組和生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞爬片對(duì)照組。各組誘導(dǎo)24～28d后，經(jīng)免疫熒光染色后，CLSM下見羊膜鋪片和切片上有DAPI藍(lán)色熒光標(biāo)記核，同時(shí)胞質(zhì)中有CK綠色熒光的細(xì)胞，表明BMSCs已分

7、化為上皮細(xì)胞。 3.誘導(dǎo)培養(yǎng)第10d，各組BMSCs表達(dá)CK細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：?jiǎn)斡醚蚰せ蛘哐蚰そ嵋赫T導(dǎo)BMSCs分化為上皮的能力強(qiáng)于對(duì)照組，P<0.05；羊膜與EGF、IGF-1聯(lián)合誘導(dǎo)作用強(qiáng)于單用羊膜組，P<0.05；終濃度30ng/mL EGF的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于50ng/mL IGF-1，P<0.05。 4.TEM下見羊膜上種植的BMSCs與結(jié)締組織見未見基膜形成，細(xì)胞間未見細(xì)胞連接。 全文結(jié)論： 1

8、.13周以內(nèi)標(biāo)本獲得的骨髓細(xì)胞首次傳代時(shí)間早，衰老出現(xiàn)時(shí)間晚；擴(kuò)增到P4時(shí)，BMSCs數(shù)量多于20～24周標(biāo)本。 2.P4-BMSCs開始表達(dá)EGF-R，P5-BMSCs開始表達(dá)IGF-1-R。提示此時(shí)是施加EGF、IGF-1等生長(zhǎng)因子的合適時(shí)間。 3.EGF和IGF-1誘導(dǎo)后，EGF-R和IGF-1-R表達(dá)CK的時(shí)間早于對(duì)照組。表明EGF和IGF-1可促進(jìn)BMSCs表達(dá)EGF-R和IGF-1-R，以及BMSCs向上皮細(xì)

9、胞分化。 4.P3-BMSCs的EGF-R和IGF-1-R阻滯后，其向上皮細(xì)胞分化的時(shí)間和數(shù)量均低于對(duì)照組，證明EGF-R和IGF-1-R可能參與了BMSCs向上皮細(xì)胞分化的調(diào)控。 5.BMSCs能在去上皮羊膜上生長(zhǎng)，并分化為能表達(dá)CK的上皮細(xì)胞。去上皮羊膜，外源性EGF和IGF-1，以及羊膜結(jié)締組織浸提液在體外都能誘導(dǎo)BMSCs向上皮細(xì)胞分化，以羊膜與外源性EGF和IGF-1聯(lián)合誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，EGF的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于IGF