MSCs移植對心肌梗死后心功能及心肺復(fù)蘇結(jié)果影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、主要研究內(nèi)容： 一．大鼠骨髓MSCs的生物學(xué)特性研究探討MSCs分離、培養(yǎng)、純化、擴(kuò)增、鑒定、標(biāo)記的方法，研究其生物學(xué)特性。 二．大鼠骨髓MSCs體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞大鼠骨髓MSCs經(jīng)5-AZA處理后，在體外定向分化為心肌細(xì)胞，并用免疫組化的方法從蛋白水平對誘導(dǎo)后的MSCs進(jìn)行心肌特異性蛋白表達(dá)進(jìn)行鑒定，確定MSCs在體外能向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 三．大鼠骨髓MSCs在體內(nèi)分化為有收縮／舒張性能的心肌細(xì)胞采用特殊的成

2、年大鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)技術(shù)，對左前降支冠狀動脈(Left anterior descemding coronary artery，LAD)結(jié)扎致心肌梗死后MSCs治療的大鼠進(jìn)行單個心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，獲得由MSCs在體內(nèi)分化而來的成熟的心肌細(xì)胞，并利用IonOptixTM系統(tǒng)觀察其收縮力，對其心肌特異性蛋白desmin、α-sarcomeric actin、troponin I的表達(dá)情況進(jìn)行免疫組化鑒定。 四．大鼠骨髓MS

3、Cs在心肌梗死和心肺復(fù)蘇模型中的應(yīng)用觀察3種不同途徑的MSCs治療(靜脈內(nèi)、左心室內(nèi)、局部梗死心肌內(nèi))對大鼠心肌梗死后心功能的影響及其后CPR的影響，探討生存于心肌組織中的MSCs能否經(jīng)受住缺血和再灌注(心跳驟停及心肺復(fù)蘇)的打擊，并維持改善了的心功能，從而為MSCs治療心血管疾病提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一章大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性研究心血管疾病的細(xì)胞治療需要足夠數(shù)量的干細(xì)胞。而骨髓中MSCs數(shù)量極少，僅占骨

4、髓細(xì)胞總量的0.001～0.01％。如何對這微量的細(xì)胞在體外進(jìn)行分離純化、大量擴(kuò)增，從而滿足實(shí)驗(yàn)及臨床細(xì)胞治療所需要的數(shù)量，是本章的研究內(nèi)容。 研究目的: 建立骨髓MSCs的體外分離培養(yǎng)方法，研究MSCs的生物學(xué)特性，為進(jìn)一步誘導(dǎo)分化和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 材料與方法: 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，4±1周齡，在無菌條件下取骨髓，用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離純化MSCs，傳代擴(kuò)增時控制胰酶消化時

5、間，在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD11b／c，CD29，CD44H，CD45，CD90.1表達(dá)。觀察熒光物質(zhì)PKH26標(biāo)記細(xì)胞后的染色及生長情況。 小結(jié): 全骨髓貼壁培養(yǎng)法和消化控制相結(jié)合能有效地分離純化大鼠骨髓MSCs，MSCs在體外培養(yǎng)具有很強(qiáng)的擴(kuò)增能力，第3代的細(xì)胞具有很高的純度又有很強(qiáng)的增殖分化能力，適用于誘導(dǎo)分化研究及細(xì)胞治療。 第二章　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化

6、為心肌細(xì)胞及其鑒定　　MSCs能否分化為心肌細(xì)胞是MSCs用于心血管疾病治療的前提和基礎(chǔ)。本章的目的在于證實(shí)MSCs在合適的誘導(dǎo)劑的作用下，能在體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，并進(jìn)行心肌細(xì)胞特異性抗體檢測。 研究目的: 探討5-AZA體外定向誘導(dǎo)大鼠骨髓MSCs分化為心肌細(xì)胞的潛能，并進(jìn)行心肌細(xì)胞特異性抗體檢測，為MSCs移植治療心血管疾病的實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。 材料與方法: 傳代培養(yǎng)的P3大鼠MSCs

7、以終濃度為10μmol／L的5-AZA誘導(dǎo)24h，然后按原培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)改變，在誘導(dǎo)后2周時采用免疫組化染色檢測心肌特異性蛋白Desmin、α-sarcomeric actin、troponin I的表達(dá)情況。 小結(jié): 5-AZA能在體外誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化，這為MSCs治療心血管疾病提供了理論基礎(chǔ)。 第三章　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)分化為有收縮／舒張性能的心肌細(xì)胞及其生物學(xué)特性研究

8、　　骨髓MSCs在體外的誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)已證實(shí)能向成體心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但在體內(nèi)是否真的能分化為心肌細(xì)胞包括搏動的心肌細(xì)胞仍然是目前MSCs移植研究中尚未明確的課題，以前在這方面的研究均是通過免疫組化的方法對心肌組織病理切片內(nèi)的MSCs進(jìn)行心肌細(xì)胞特異性蛋白的鑒定，來明確所移植的MSCs在體內(nèi)是否向心肌樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，但這些細(xì)胞是否能象正常的心肌細(xì)胞一樣具有收縮／舒張性能，科學(xué)界并沒有進(jìn)行證實(shí)。本研究利用成年心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng)的成熟經(jīng)驗(yàn)，將PKH

9、26標(biāo)記的MSCs注入梗死部位的心肌內(nèi)，6周后對治療后的心臟進(jìn)行離體消化，獲得了由PKH26標(biāo)記的MSCs分化而來的具有收縮／舒張性能的活的心肌細(xì)胞，為MSCs移植治療心血管疾病提供了關(guān)鍵的證據(jù)。研究目的采用特殊的成年大鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)技術(shù)，對冠狀動脈左前降支結(jié)扎致心肌梗死后MSCs治療的大鼠進(jìn)行單個心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，獲得由MSCs在體內(nèi)分化而來的成熟的心肌細(xì)胞，并對其收縮力及心肌特異性蛋白desmin、α-sarcomeri

10、c actin、troponin I的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。 材料與方法: LAD結(jié)扎1周后大鼠開胸并在梗死心肌內(nèi)局部注射5×106MSCs進(jìn)行治療，注射后6周采用特殊的成年大鼠心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng)技術(shù)對治療后的心臟進(jìn)行單個心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)。利用IonOptixTM系統(tǒng)，觀察和記錄了所獲得的由PKH26標(biāo)記的MSCs分化而來的大鼠心肌細(xì)胞的長度及收縮／舒張功能，并用免疫組化的方法檢測由MSCs分化而來的心肌細(xì)胞的特異性抗原

11、表達(dá)。 小結(jié): 1.采用特殊的成年大鼠心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng)技術(shù)能分離得到由PKH26標(biāo)記的MSCs分化而來的心肌細(xì)胞。 2.PKH26標(biāo)記的MSCs分化的心肌細(xì)胞具有與正常心肌細(xì)胞無異的收縮和舒張功能。 3.PKH26標(biāo)記的MSCs分化的心肌細(xì)胞表達(dá)心肌特異性蛋白desmin、α-sarcomeric actin、troponin I。 第四章　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在心肌梗死和心肺復(fù)蘇模型中的應(yīng)用　　

12、利用細(xì)胞移植的方法來增加有功能的心肌細(xì)胞的數(shù)量，從而改善心功能已成為心血管疾病治療的新途徑。以前的心肺復(fù)蘇研究使用的均是健康的動物，且研究的重點(diǎn)放在復(fù)蘇后藥物的選擇及各種器械如何改進(jìn)復(fù)蘇后血流動力學(xué)。但臨床實(shí)際情況是在CPR發(fā)生之前病人大多有嚴(yán)重的心臟疾病，因而本課題研究力圖盡量接近臨床實(shí)際，首先結(jié)扎LAD，造成較嚴(yán)重的心肌缺血，4周后注射MSCs或PBS，治療的干預(yù)措施提到了CPR之前，治療4周后再誘發(fā)心室顫動(Ventricular

13、 fibrillation，VF)及進(jìn)行CPR，觀察MSCs治療對心肌梗死后心功能及其后的CPR的影響，從而為MSCs治療心肌梗死及改進(jìn)CPR的結(jié)果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時，生存于缺血心肌中的MSCs能否經(jīng)受住第二次缺血缺氧的打擊并維持改善的心功能，也是我們研究的重點(diǎn)之一。 研究目的: 觀察MSCs對大鼠心肌梗死后心功能的影響及其后CPR的影響，從而為MSCs治療心血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法: 首先結(jié)扎

14、SD大鼠LAD，4周后通過靜脈、左心室內(nèi)、梗死心肌局部3種不同途徑注射PKH26標(biāo)記的5 × 106SCs，注射后2周及4周觀察各組心功能改善情況，并在4周時誘導(dǎo)VF及CPR，觀察比較CPR時各組血流動力學(xué)的改變及復(fù)蘇后生存時間。 全文主要結(jié)論: 1.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法和胰酶消化控制相結(jié)合的方法能有效純化分離大鼠骨髓MSCs。MSCs能在體外迅速擴(kuò)增，生長性狀穩(wěn)定，體外培養(yǎng)骨髓MSCs可以滿足實(shí)驗(yàn)研究及臨床細(xì)胞治療的需

15、要。PKH126具有很好的染色效果及安全性，是移植細(xì)胞體內(nèi)示蹤的較佳選擇。 2.大鼠骨髓MSCs在體外經(jīng)5-AZA誘導(dǎo)后可向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)后的MSCs表達(dá)心肌特異性蛋白desmin、α-sarcomeric actin、troponin I。表明MSCs在一定的條件下可向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 3.采用特殊的成年心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng)的方法可分離得到PKH26標(biāo)記的MSCs在體內(nèi)分化而成的搏動的心肌細(xì)胞，搏動幅度及心肌特異性蛋白

16、desmin、α-sarcomeric actin、troponin I表達(dá)與正常的心肌細(xì)胞無異。 4.大鼠心肌梗死后采用3種不同途徑(靜脈內(nèi)、左心室內(nèi)、局部梗死心肌內(nèi))MSCs注射治療，心功能同樣明顯改善。在CPR過程中及復(fù)蘇后4h的CI、dp／dt40、-dp／dt、LVDP結(jié)果及復(fù)蘇后的生存時間明顯優(yōu)于對照組。3種不同注射途徑治療后的心臟病理切片發(fā)現(xiàn)有大量的PKH26標(biāo)記的細(xì)胞存在，局部心肌內(nèi)注射組的MSCs數(shù)量顯著高于靜