逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測人星狀病毒1型.pdf

1、研究背景：
　　 人星狀病毒(Human Astrovirus,HAstV)首次于1975年由Appleton和Higgins用電鏡檢測胃腸炎患兒糞便標本時發(fā)現(xiàn)。星狀病毒屬單獨的星狀病毒科,星狀病毒屬,無衣殼單股正鏈RNA病毒。病毒顆粒直徑約28 nm,由于電鏡下病毒顆粒呈星形,因此被Madeley和Cosgrove命名為星狀病毒。病毒基因全長618 kb,包含有三個開放閱讀框架(open reading frames):ORF

2、1a、ORF1b、ORF2。ORF1a、ORF1b在5'端,為高度保守區(qū)域,主要編碼蛋白酶及RNA多聚糖；ORF2在3'端,基因長度為2388 kb,為多變區(qū),該區(qū)域主要編碼衣殼蛋白；此外,基因組還包括一個5'非編碼區(qū)與一個3'端非編碼區(qū)及一個約30個核苷酸的多聚核苷酸尾。
　　 HAstV是引起嬰幼兒腹瀉的最主要的病原之一,對志愿者和自然感染者的研究均證實它與腹瀉密切相關(guān)。世界各地均已有HAstV感染的報道,既可散發(fā)也可以引起

3、暴發(fā)流行,亦可引起醫(yī)源性感染。與輪狀病毒相似,HAstV感染多發(fā)生在2歲以內(nèi)尤其是1歲以內(nèi)的嬰幼兒。住院腹瀉患兒中HAstV檢出率為2.5％～9.0％,目前被認為是嬰幼兒病毒性胃腸炎的第二位病因,僅次于輪狀病毒。此外,老年人和免疫缺陷患者也是HAstV感染的高危人群,人類免疫缺陷病毒感染者、接受骨髓移植及聯(lián)合免疫缺陷患者發(fā)生該病毒感染均已有報道。HAstV亦是健康成年人發(fā)生胃腸炎的病因之一。
　　 應(yīng)用多克隆抗體和單克隆抗體,可

4、將HAstV劃分為8個血清型。HAstV廣泛分布于世界各地,各血清型流行情況因地區(qū)和流行年不同而有所不同,其中多以血清型1型為主。HAstV感染具有較明顯的季節(jié)性,一般在溫帶地區(qū)的流行季節(jié)為冬季,而在熱帶地區(qū)的流行季節(jié)則為雨季。HAstV血清流行病學的研究顯示,5歲兒童抗1型HAstV的IgG抗體陽性率達90％,說明兒童5歲以前對HAstV已有廣泛的接觸。人們先后從貓、羊、豬等動物糞便中及淤泥、湖水中分離出了星狀病毒,Miossee報道

5、曾從甲殼類水生物中分離出該病毒,提示星狀病毒有可能像甲型肝炎病毒一樣通過甲殼類水生物傳播。
　　 簡便、快速地檢測HAstV,一直是人們研究的課題。目前檢測HAstV常用的方法有:1.電鏡法(electronic microscope):Appleton等于1975年首次用電鏡發(fā)現(xiàn)了HAstV,此后十多年時間里,電鏡是檢測該病毒的主要方法。此方法形象、直觀,但僅有10％的星狀病毒具有典型的星形外觀,故敏感性較低。若在標本中加入熒

6、光標記的抗體,可提高檢出率,稱為免疫電鏡法。當病毒滴度低時,免疫電鏡法仍有較高的假陰性,且由于價格昂貴,技術(shù)條件要求高,不適合大規(guī)模的流行病學調(diào)查。2.細胞培養(yǎng)(cell culture)和病毒分離(virus separate):1977年Lee和Kurtz采用人胚腎細胞成功分離了HAstV。1990年Willcocks等采用傳代細胞系人類結(jié)腸癌細胞(CaCo-2)直接從腹瀉標本中分離出HAstV,且HAstV于CaCo-2細胞內(nèi)增殖

7、良好,這使HAstV的檢測方法發(fā)生了里程碑的進步。人們可利用增殖的病毒制備不同血清型的單克隆抗體,這為以后應(yīng)用酶免疫法進行大量流行病學調(diào)查奠定了基礎(chǔ),正因為如此,星狀病毒腹瀉才逐漸為大家所認識和重視。3.酶免疫法(enzyme immunoassay,EIA)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):Herrmand等在成功制備HAstV單克隆抗體的基礎(chǔ)上建立了EIA和ELIS

8、A,該法操作更簡單,具有更好的敏感性及特異性,并能進行分型。但用于檢測的單克隆抗體在商業(yè)上往往很難獲得且價格昂貴,故作為常規(guī)檢測方法在目前有較大的困難。4.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR):隨著對星狀病毒培養(yǎng)、分離及測序的成功,星狀病毒的RT-PCR檢測法也就應(yīng)運而生。從1993年開始,RT-PCR就應(yīng)用于檢測星狀病毒,并與EIA進行了對比,發(fā)現(xiàn)RT-PCR法比EIA有更高的敏感性及特異性,不受難以獲得的血清抗體的限制,故目前大多數(shù)

9、星狀病毒的報道均是用該法進行研究。5.血清學檢測:HAstV血清學檢測方法包括免疫電鏡(IEM)、放射免疫法(RIA)、免疫熒光法(IFA)、酶免疫法(EIA)等。血清學檢測方法可幫助了解HAstV感染狀況,目前認為其特異性抗體僅具有部分保護作用,故現(xiàn)在開展得較少。
　　 LAMP法利用酶反應(yīng)系統(tǒng)直接擴增靶核酸序列,能使靶核酸序列呈指數(shù)級擴增,在45～60min的時間里可達到109～1010數(shù)量級:反應(yīng)過程不需控制溫度的變化,在

10、恒溫水浴加熱即可進行,省去了昂貴的熱循環(huán)儀的費用。由于兩對引物在靶基因上的6個不同部位完全匹配才能進行擴增,所以LAMP法具有很高的特異性。在DNA合成時,從脫氧核酸三磷酸基質(zhì)(dNTP)中析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子反應(yīng),產(chǎn)生大量焦磷酸鎂白色沉淀,因此可以把渾濁度作為反應(yīng)的指標,僅用肉眼觀察白色渾濁沉淀就能鑒定擴增與否,而不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。有時,通過肉眼觀察白色沉淀來判斷會存在一定的誤差,日本榮研株式會社利用LAM

11、P反應(yīng)過程中產(chǎn)生焦磷酸鎂白色沉淀,研制出專門用于LAMP檢測的實時濁度儀,以實現(xiàn)對LAMP擴增過程的實時監(jiān)控,使擴增和檢測同時完成。此外,還可通過添加熒光染料,如溴化乙錠(EB)、SYBR GreenⅠ等進行染色,來檢測擴增是否發(fā)生。LAMP反應(yīng)的最終擴增產(chǎn)物是分子量大小不等的莖環(huán)DNA組成的混合物,在2％的瓊脂糖凝膠上電泳呈現(xiàn)的是典型的梯狀條帶。LAMP法由于具有操作簡便易行、特異性高、結(jié)果判斷簡單等多方面的優(yōu)點,故本法一經(jīng)面世就被應(yīng)

12、用到很多方面,包括人類、動物和植物致病微生物的檢測、動物胚胎性別的鑒別和轉(zhuǎn)基因食品的檢測等。
　　 研究目的：
　　 建立一種快速檢測人星狀病毒Ⅰ型的環(huán)介導等溫擴增方法。
　　 研究方法
　　 1.標本的收集
　　 1份HAstV-1型和1份札幌病毒GⅡ型陽性糞便標本來源于中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所,2份諾如病毒GⅡ型、3份輪狀病毒A組陽性糞便標本由本實驗室保存,80份腹瀉患者糞便標本于

13、2006年8月至2007年1月期間收集于江門市婦幼保健醫(yī)院兒科門診,以及江門市人民醫(yī)院急診科和腹瀉門診。收集的糞便標本用PH7.2的PBS配制成懸液保存于-40℃。
　　 2.引物設(shè)計
　　 針對編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的基因組保守區(qū)域ORF1a,通過ClustalW2在線軟件比對GeneBank上已公布的ORF1a序列確定LAMP目標序列,輸入在線軟件PrimerExplorer V4設(shè)計出特異的RT-LAMP引物,其序列(5'

14、-3')為:F3:GCATTATCTTCTTGTGCTTCA；B3:TCACGGATCTCGAACCTG；FIP:CCACCAGCAATTAATACTGCTGTAGGAAGACTCCAACTATGTGAGC;BIP:GCACGACCACGTCATTGTTTCAATGAAAACAGTTGCCATAC。
　　 3.RNA的提取
　　 用Trizol法從收集的糞便標本提取RNA并溶于DEPC處理水,測定其230nm、260nm

15、、280nm和310nm的OD值,保存于-80℃。
　　 4.RT-LAMP條件優(yōu)化、產(chǎn)物的檢測和酶切鑒定
　　 反應(yīng)體系置60℃恒溫反應(yīng)45min、60min、75min、90min,最后80℃孵育5min以滅活酶終止反應(yīng)。產(chǎn)物通過凝膠電泳后溴化乙錠染色紫外線下觀察,以及熒光染料SYBR Green Ⅰ染色后肉眼觀察。對RT-LAMP產(chǎn)物進行切膠、稱重,經(jīng)凝膠回收試劑盒純化回收后用限制性內(nèi)切酶TaaI進行切割,凝膠電泳

16、觀察酶切片段。
　　 5.RT-PCR和RT-LAMP檢測HAstV-1型的特異性、敏感性分析
　　 5.1 以RT-LAMP的外引物F3、B3作為RT-PCR的上、下游引物進行RT-PCR擴增,對其產(chǎn)物進行切膠、稱重,經(jīng)凝膠回收試劑盒純化回收后,與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α。通過藍白斑篩選試驗挑出白色菌落接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng),再提取質(zhì)粒DNA作模板用引物F3、B3進行PCR擴

17、增來鑒定篩選正確的克隆。測定質(zhì)粒溶液230nm、260nm、280nm和310 nm的OD值,將濃度為2.3x108copies/μl質(zhì)粒DNA溶液保存于-20℃?zhèn)溆谩?br>　　 5.21份HAstV-1型、1份札幌病毒GⅡ型、2份諾如病毒GⅡ型、3份輪狀病毒A組陽性糞便標本作為檢測對象,提取RNA同時進行RT-LAMP和RT-PCR檢測。
　　 5.3 HAstV-1型陽性標本所提取RNA的一系列稀釋度為:lng/μl,1

18、00pg/μl,10pg/μl,lpg/μl,100fg/μl,10fg/μl,分別作模板用RT-LAMP和RT-PCR檢測。
　　 5.4質(zhì)粒DNA濃度按10×梯度稀釋,其濃度為2.3x107copies/μl到23copies/μl,并作模板用LAMP和PCR檢測。
　　 6.檢測臨床腹瀉患者糞便標本
　　 80份非細菌性腹瀉患者糞便標本提取RNA后,同時用RT-LAMP和RT-PCR檢測。
　　 結(jié)