蛋白微陣列免疫測定在致病菌檢測中的方法研究及應(yīng)用.pdf

1、本論文由四個部分組成：1.研究概況和目標(biāo)；2.抗體蛋白的提純和標(biāo)記；3.蛋白微陣列芯片在細菌免疫檢測中的應(yīng)用研究；4.蛋白微陣列芯片技術(shù)用于2005年渤海海區(qū)4種弧菌及大腸桿菌分布特征的研究。 第一章主要介紹研究概況和目標(biāo)。綜述了生物芯片包括基因芯片和蛋白芯片的原理、產(chǎn)生和發(fā)展，蛋白質(zhì)微陣列芯片的制備及一般分析過程及主要的分析儀器，介紹了蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀；水體中細菌檢測的傳統(tǒng)方法、免疫學(xué)方法和生物芯片方法(包括基

2、因芯片和蛋白芯片)的研究現(xiàn)狀等。在此基礎(chǔ)上提出了本論文的主要研究方向，即應(yīng)用蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)實現(xiàn)對細菌的定量檢測，并進一步將此項技術(shù)運用于渤海海區(qū)海洋致病菌的檢測。 第二章主要研究了抗體蛋白的提純和標(biāo)記。提純結(jié)果表明鹽析法—蛋白A親和層析法具有很好分離提純效果；通過分別用FITC、RBITC和Cy3三種熒光染料標(biāo)記抗體蛋白，研究標(biāo)記后抗體蛋白的紫外和熒光光譜等特性，說明Cy3作為蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記物更優(yōu)于FITC和RBITC，具有摩

3、爾吸光系數(shù)高、水溶性好、易于標(biāo)記等優(yōu)點，作為蛋白芯片標(biāo)記物具有效率高、熒光強度大、檢測靈敏度高、實用的特點。 第三章主要建立了一種用于水體中細菌檢測定量(以副溶血弧菌、河弧菌和大腸桿菌3種細菌作為研究對象)的蛋白微陣列免疫分析法。以Cy3標(biāo)記抗體蛋白為探針，蛋白芯片為載體，對孵育反應(yīng)的IgG(immunoglobulinG，抗體蛋白)濃度、反應(yīng)時間、溫度、免疫檢測方式等條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明：當(dāng)IgG濃度為0.1mg/ml，在

4、37℃下孵育60min，采用芯片免疫直接法檢測可以獲得理想的檢測效果；在優(yōu)化條件下采用芯片免疫直接法檢測，副溶血弧菌、河弧菌和大腸桿菌的檢測限分別為9.9×104個/ml、9.3×104個/ml和3.9×105個/ml；將本方法與ELISA進行了比較，結(jié)果表明，本方法具有快速、操作便捷、高通量檢測、絕對靈敏度高的特點；將本方法應(yīng)用于海水樣中這3種致病菌定量檢測表明本方法具有很好的快速、準(zhǔn)確的特性。 第四章主要介紹了在2005年渤

5、海春季和夏季兩個航次中的使用免疫蛋白芯片檢測技術(shù)對渤海自然海區(qū)海水中的4種海洋致病弧菌和大腸桿菌的存在分布進行了初步研究，其中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌、哈維氏弧菌和大腸桿菌。由于實際環(huán)境中的細菌濃度水平不高，所以使用蛋白芯片檢測前需要預(yù)富集。研究結(jié)果表明，1)所檢測的5種細菌總菌數(shù)在夏季的數(shù)量要高于春季，其平均菌數(shù)分別為2.48×105個/L和3.05×104個/L；2)5種細菌的數(shù)量在夏季比春季都有一定增加，特別河弧菌數(shù)量是春

6、季的15.41倍；3)在夏季，渤海灣5種病原菌總數(shù)量分別是遼東灣，萊州灣和渤海中部的4.87，10.52和7.15倍；4)沿岸地區(qū)的菌數(shù)為渤海中部的4.68倍，表明所檢測的5種細菌的數(shù)量由沿岸向渤海海區(qū)中部遞減的趨勢。在國內(nèi)對渤海海區(qū)大范圍的致病菌存在分布的監(jiān)測研究尚屬首次，本研究結(jié)果表明免疫蛋白芯片檢測技術(shù)用于海洋細菌的常規(guī)監(jiān)測具有很大的發(fā)展空間。 本工作的主要創(chuàng)新點在于：通過對蛋白質(zhì)微陣列方法的研究，建立了一種用于水體中細菌