腺病毒介導PTEN基因對結腸癌細胞生物學行為的影響.pdf

1、目的：結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，在我國部分地區(qū)已經(jīng)超過直腸癌，從而明顯改變了我國長期以來大腸癌中以直腸癌為主的格局。這種發(fā)病趨勢與西方發(fā)達國家中結直腸癌的發(fā)病情況趨向一致。目前手術仍是治療結腸癌最主要而有效的方法。但是5年生存率一直未有明顯提高。因此，如何改善預后、提高生存率是亟待解決的問題。隨著分子生物學的發(fā)展，腫瘤的基因治療取得了明顯的進展，越來越多的基因治療方案獲準或正在進行臨床試驗。目前國際上已經(jīng)有

2、近千項基因治療方案獲準進入臨床試驗。抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的特殊作用而使抑癌基因療法成為腫瘤基因治療的重要策略之一。新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因PTEN基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及其它許多方面發(fā)揮重要的作用。PTEN基因在結腸癌，尤其是進展期結腸癌中的突變率較高，將其作為結腸癌基因治療的靶基因可能具有重要的研究價值。為此，本課題構建攜帶PTEN基因的重組腺病毒載體，體外轉染PTEN基因缺失的LoVo細胞株，觀察PTEN基因重組腺病毒對結腸

3、癌細胞生物學行為影響，以期為結腸癌的基因治療提供新的途徑。 方法：第一部分：PTEN基因重組腺病毒的構建。分別雙酶切pBP-PTEN質粒和pDC315質粒，回收并純化PTENcDNA片斷和pDC315質粒的大片斷，使二者連接獲得含有PTEN基因的重組穿梭質粒載體，酶切鑒定證實構建成功。采用位置特異性重組方法構建PTEN基因重組腺病毒載體。用脂質體介導pDC315.PTEN和pBHGlox△E1,3Cre共轉染293細胞產(chǎn)生PTE

4、N基因重組腺病毒，經(jīng)293細胞擴增，純化制取高滴度重組腺病毒。以相同的方法擴增和純化Ad.LacZ。第二部分：PTEN基因重組腺病毒對LoVo細胞生物學行為的影響。檢測Ad.LacZ對LoVo細胞的轉染效率以確定Ad.PTEN的MOI，WesternBlot檢測PTEN基因的表達，MTT法檢測Ad.PTEN轉染后LoVo細胞生長的變化，雙層軟瓊脂克隆形成實驗檢測其克隆形成率，流式細胞術技術檢測轉染后細胞周期及凋亡的變化，Borden小室

5、實驗檢測其侵襲運動能力的變化，WesternBlot檢測轉染前后LoVo細胞nm23-H1表達的變化。 結果：①用位置特異性重組方法成功構建了攜帶人PTEN基因的重組腺病毒載體(Ad.PTEN)，其滴度約5×1010pfu/ml；②確定Ad.PTEN對LoVo細胞的最佳感染復數(shù)4為50，并檢測Ad.PTEN轉染LoVo細胞后各時相點PTENmRNA及PTEN的表達，顯示PTEN基因的轉錄及翻譯表達隨轉染時間延長逐漸增加。③Ad.

6、PTEN轉染LoVo細胞后，可顯著抑制其生長和增殖，G1期比例顯著增高，細胞凋亡率明顯增加，克隆形成率明顯降低，侵襲運動能力下降，nm23-H1表達水平上調。 結論：①應用位置特異性重組方法成功構建了PTEN基因的重組腺病毒載體Ad.PTEN經(jīng)293細胞擴增、純化后獲得高滴度的重組腺病毒。②Ad.PTEN轉染靶細胞后可穩(wěn)定、顯著的表達。③Ad.PTEN轉染LoVo細胞后可以明顯抑制LoVo細胞的生長，發(fā)生G1期阻滯，細胞凋亡率增