轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡抑制基因水稻抗紋枯病和爛秧病研究.pdf

1、本研究為了獲得具廣譜和持久抗性的水稻新種質(zhì)，抵抗壞死營(yíng)養(yǎng)型病原菌誘發(fā)的多種病害和生產(chǎn)過(guò)程中的多種逆境，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法首次將來(lái)源于昆蟲(chóng)桿狀病毒的細(xì)胞凋亡抑制基因Op-iap和p35導(dǎo)入水稻中。 依目的基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)了三對(duì)引物，從昆蟲(chóng)表達(dá)載體pIE1-4opiap和pIE1-4p35中擴(kuò)增了細(xì)胞凋亡抑制基因iap和p35。Op-iap基因的編碼區(qū)長(zhǎng)807bp，編碼一個(gè)由268個(gè)氨基酸組成的，分子量約為30kDa具有抑制細(xì)胞

2、凋亡功能的蛋白；p35基因長(zhǎng)為900bp，編碼一個(gè)由299個(gè)氨基酸組成的，分子量約為35kDa的具有抑制細(xì)胞凋亡功能的蛋白。將兩個(gè)基因單獨(dú)及其組合分別插入pCAMBIA1301，構(gòu)建了三個(gè)植物表達(dá)載體p1301-iap、p1301-p35和p1301-iap-p35，經(jīng)PCR檢測(cè)、酶切鑒定和核苷酸序列測(cè)定等分析確認(rèn)構(gòu)建無(wú)誤。 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法通過(guò)構(gòu)建的載體將目的基因和對(duì)照(gus基因)導(dǎo)入粳稻品種“中花8號(hào)”、“中花10號(hào)”

3、和“Aichiasahi”，共獲得轉(zhuǎn)基因水稻485株。經(jīng)Southern-blot、Northern-blot和RT-PCR分析，導(dǎo)入的基因已整合到轉(zhuǎn)基因植株的基因組中，并轉(zhuǎn)錄了完整的mRNA。利用PCR擴(kuò)增結(jié)果對(duì)T1代的外源基因分離進(jìn)行了遺傳分析，結(jié)果表明：目的基因在T1代中符合孟德?tīng)柗蛛x比例，并與選擇標(biāo)記基因緊密連鎖。 接種立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)并調(diào)查轉(zhuǎn)基因水稻的發(fā)病級(jí)別，計(jì)算平均病級(jí)及病情指數(shù)。接

4、種20天時(shí)，提取病斑周?chē)M織的DNA，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，觀察細(xì)胞凋亡的典型標(biāo)志DNA片段化。觀察、計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，導(dǎo)入了細(xì)胞凋亡抑制基因的“中花8號(hào)”T0代植株能夠抑制壞死營(yíng)養(yǎng)型病原真菌侵染誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，顯著地提高了受體品種對(duì)稻紋枯病的抗性。 轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡抑制基因水稻的T1代幼苗能夠抑制在低溫、弱光、短日照等不良環(huán)境條件下由立枯絲核菌(Rhizoctonisolani)侵染誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，顯著地提高了秧苗的存活率和抗