辣椒疫霉效應(yīng)蛋白PcAvh1與植物互作因子的鑒定和功能分析.pdf

1、辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)是一種重要的植物病原卵菌，常危害茄科、葫蘆科、豆科等多種農(nóng)作物。在與寄主植物的互作過程中，辣椒疫霉分泌大量的效應(yīng)分子進(jìn)入植物細(xì)胞，激活或者抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)，以利于病原物的侵染與定殖。植物為了抵抗病原物的入侵，激活相應(yīng)的防衛(wèi)反應(yīng)。深入研究疫霉與植物互作的機(jī)制，對(duì)明確疫霉菌致病機(jī)理、設(shè)計(jì)植物疫病控制新策略具有重要的意義。
　　RXLR蛋白是卵菌中一類重要的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)

2、分子，進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)觸發(fā)或者抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)，以利于病原物建立侵染定殖，引致病害的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉中的一個(gè)RXLR效應(yīng)分子PcAvh1能夠觸發(fā)模式植物本氏煙的細(xì)胞死亡(Plant celldeath，PCD);沉默PcAvh1基因?qū)е吕苯芬呙箚适?duì)辣椒和本氏煙的致病力。這些結(jié)果表明該效應(yīng)分子是辣椒疫霉中一個(gè)重要的毒性因子，但尚不清楚該效應(yīng)分子如何參與辣椒疫霉的侵染致病過程。本論文通過鑒定PcAvh1在植物中的互

3、作因子，為認(rèn)識(shí)辣椒疫霉的致病機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本論文首先利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)分析了PcAvh1是否能夠引起三生煙、辣椒和番茄的PCD。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PcAvh1可以在番茄(L402、中雜9號(hào)和毛粉802品種)上引起PCD，在辣椒（牛角椒和甜椒品種）上引起嚴(yán)重的黃化現(xiàn)象，但在三生煙上不引起明顯的反應(yīng)。
　　本論文然后通過酵母雙雜交技術(shù)，以PcAvh1為誘餌蛋白，在辣椒疫霉侵染本氏煙的cDNA文庫中篩選與其互

4、作的植物蛋白，獲得2個(gè)植物蛋白:PP2A-1和PP2A-2（蛋白磷酸酶2A的調(diào)節(jié)亞基及其同源異構(gòu)體）。隨后，雙分子熒光互補(bǔ)分析證明PcAvh1與PP2A之間存在相互作用。
　　接著，本論文利用qRT-PCR技術(shù)分析植物蛋白磷酸酶2A編碼基因在本氏煙受辣椒疫霉侵染的不同階段（辣椒疫霉接種本氏煙1.5、3、6、12、24、36、72 h后）以及本氏煙不同組織部位的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PP2A在本氏煙受辣椒疫霉侵染的階段差異表達(dá);相比于

5、不同的組織部位，PP2A基因在本氏煙的花中高量表達(dá)。
　　為了進(jìn)一步分析植物互作蛋白的功能，本論文利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，沉默2個(gè)PP2A基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PP2A單基因沉默后本氏煙生長發(fā)育正常，而PP2A雙基因沉默后本氏煙生長發(fā)育受到嚴(yán)重影響，表現(xiàn)出矮小癥狀;PP2A單基因或者雙基因沉默均導(dǎo)致本氏煙對(duì)辣椒疫霉侵染的抗性下降。在PP2A沉默的本氏煙植株中表達(dá)PcAvh1，發(fā)現(xiàn)PP2A的單基因或雙基因沉默未影響PcAvh1觸發(fā)本氏

6、煙的PCD反應(yīng)。上述結(jié)果表明，PP2A在植物抵抗疫霉菌的侵染過程中起著重要的作用。
　　本論文通過酵母雙雜交技術(shù)獲得了與PcAvh1互作的本氏煙蛋白PP2A;利用qRT-PCR明確了PP2A基因在本氏煙面臨辣椒疫霉侵染時(shí)差異表達(dá)，而且在本氏煙不同組織部位的表達(dá)水平不一;進(jìn)一步利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)分析了PP2A的功能，發(fā)現(xiàn)PP2A對(duì)于本氏煙抵抗疫霉菌侵染具有重要的作用。本論文的研究結(jié)果對(duì)認(rèn)識(shí)辣椒疫霉與植物的互作機(jī)制提供了重要的