端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）在白血病中的表達(dá)及其與WT1的相關(guān)性研究.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）在白血病中的表達(dá)及其與WT1的相關(guān)性研究姓名：劉靜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：腫瘤內(nèi)科指導(dǎo)教師：劉云鵬20030301臨床資料1 病例選擇：選取就診于我院的7 9 例急、慢性白血j i ；{ 病人，其中男性3 9 例，女性4 0 例，年齡為L(zhǎng) 2 至7 5 歲，3 F 均年齡4 0 ．3 歲。包括急性髓性自m 病( ^ M L ) 3 9 例，急性淋巴細(xì)胞自血病( A L l ．) 2 1

2、 例，慢性粒細(xì)胞I C I J I U 病慢f 4 ：l O ] ( C M L - c p ) 1 2 例，慢性粒細(xì)胞白血病加速／急變期( C M L - a D ) 7例。全部病例均經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)檢查，符合F A B 診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選1 3 例正常人或非l f n 液系統(tǒng)疾病病人為對(duì)照，經(jīng)骨髓涂片及活鰣【織檢查未見(jiàn)特征性血液病改變。2 研究方法：2 ．1 單個(gè)核細(xì)胞分離：抽取肝索化骨髓或外周血3 - 5 m l ，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離單

3、個(gè)核細(xì)胞。將細(xì)胞濃度調(diào)至l X 1 0 6 ／m l ，取少量細(xì)胞經(jīng)離心制成細(xì)胞涂片。余加入T R I Z O L 裂解液于4 ℃保存?zhèn)溆谩? ．2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色：以慢性粒細(xì)胞自『血病急性變細(xì)胞系1 ( 5 6 2 細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照，使用1 ：1 0 0 稀釋的h T E R 。r 兔抗人多克隆抗體( 美國(guó)S A N T AC R U Z 公司產(chǎn)品) ，S - P 免疫組化試劑盒檢測(cè)正常對(duì)照或白m 病患者骨髓或外周血標(biāo)本中h T E

4、R T 表達(dá)，常規(guī)抗體稀釋液代替～抗作為陰性對(duì)照。胞核染成棕黃色為陽(yáng)性。于高倍鏡下{ 1 ‘?dāng)?shù)3 0 0 個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)大于2 0 ％視為陽(yáng)性。2 ．3 逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( R T —P C R ) 半定量測(cè)定w T 】m R N A 水平：取于T R l Z O L 中保存的細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明提取總R N A 。用紫外分光光度計(jì)( 波長(zhǎng)2 6 0 n m ) 進(jìn)行F t N A 定最，逆轉(zhuǎn)錄合成c D N A 第～鏈，

5、之后參照文獻(xiàn)行P C R 擴(kuò)增，再將擴(kuò)增產(chǎn)物在1 ．3 ％瓊脂糖凝膠( 含0 ．5 u g ，／m l 溴化乙錠)中電泳( 1 0 0 V ，4 0 分鐘) ，然后用G D S 8 0 0 0 凝膠成像分析儀照相、分析。以無(wú)模板P e R 產(chǎn)物為陰性對(duì)照，B ～a c t i n 為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。t N T lm R N A 的相對(duì)表達(dá)水平用W T l 的P C R 電泳結(jié)果掃描值／p —a c t i n 的P C R 電泳結(jié)果掃描值來(lái)確