產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的肺炎克雷伯菌耐藥性及新基因、整合子研究.pdf

1、目的：
　　 了解安徽省2007年臨床分離的180株肺炎克雷伯菌產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC β-內(nèi)酰胺酶的情況及產(chǎn)酶菌株的耐藥性。
　　 研究產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC β-內(nèi)酰胺酶陽性菌株的耐藥基因型別的分布。
　　 研究新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的分子生物學(xué)特性及Ⅰ類整合子的檢測定位。
　　 材料和方法：
　　 收集安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)控網(wǎng)中的33家醫(yī)院2007年9月（9月1日到30日）從臨床標(biāo)本（去除同一病例相同部

2、位重復(fù)分離的菌株）中分離的肺炎克雷伯菌180株，采用全自動(dòng)微生物分析儀對標(biāo)本進(jìn)行重新鑒定。
　　 經(jīng)頭孢西丁紙片法試驗(yàn)初篩出產(chǎn)AmpC酶菌株，對初篩陽性的細(xì)菌，采用三維試驗(yàn)篩選。經(jīng)質(zhì)粒提取和多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增攜帶AmpC酶菌株基因，陽性菌株進(jìn)一步行全編碼引物PCR擴(kuò)增，將全編碼區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按Sanger雙脫氧末端終止法，用自動(dòng)測序儀對其進(jìn)行測序以鑒定基因型。對其中測序證實(shí)有基因突變的菌株行克隆測序。并用瓊脂平板稀

3、釋法測定AmpC陽性菌株對17種抗菌藥物的耐藥性。
　　 將一株攜帶新酶全編碼基因的細(xì)菌轉(zhuǎn)移結(jié)合到受體菌E.Coli J53中，接合子用含100mg/L的疊氮納和2mg/L頭孢西丁的LB瓊脂平板篩選。采用Southern Blotting試驗(yàn)再次驗(yàn)證新酶是否由質(zhì)粒介導(dǎo)并定位其編碼基因所在質(zhì)粒的大小。
　　 將新酶全編碼基因克隆入表達(dá)載體pHSG398，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109，用加有抗菌藥物的瓊脂平板進(jìn)行

4、轉(zhuǎn)化株篩選。用瓊脂平皿稀釋法對野生株、接合子與轉(zhuǎn)化株同時(shí)進(jìn)行MIC測定。
　　 采用超聲破碎法進(jìn)行產(chǎn)新酶細(xì)菌轉(zhuǎn)化株的粗酶提取，粗酶純化后，等電聚焦電泳測定其pI。SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色測定新酶分子量大小，進(jìn)行酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，以初步了解新酶的動(dòng)力學(xué)特性。
　　 同時(shí)對該突變菌株及其結(jié)合子行Ⅰ類整合子保守序列的擴(kuò)增及測序，并采用Southern Blotting試驗(yàn)驗(yàn)證Ⅰ類整合子保守序列是否由質(zhì)粒介導(dǎo)并定位其編碼

5、基因所在質(zhì)粒的大小。
　　 結(jié)果：
　　 180株肺炎克雷伯菌經(jīng)目的基因測序后確證產(chǎn)AmpC酶的菌株有21株，占11.67％。其中DHA型19株，EBC型4株，有3株檢出新基因(GenBank登錄號(hào)為FJ237366，F(xiàn)J237367，F(xiàn)J237368)；藥敏結(jié)果顯示產(chǎn)酶株均為多重耐藥，除亞胺培南與美羅培南外，對三、四代頭孢菌素，氨基糖苷類及喹諾酮類均有不同程度的耐藥性。
　　 突變株K.pneumonia E7

6、01經(jīng)轉(zhuǎn)移接合實(shí)驗(yàn)及Southern雜交證實(shí)其攜帶的AmpC酶全編碼基因?yàn)橘|(zhì)粒介導(dǎo)。新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的耐藥譜未發(fā)生顯著變化。新酶全編碼基因經(jīng)克隆表達(dá)，提酶純化后，等電點(diǎn)測定為8.4，且酶對頭孢西丁有高水解率。這種等電點(diǎn)為8.4的酶的活性不能被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制。
　　 突變株Ⅰ類整合子保守序列的擴(kuò)增測序解釋了其對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性，Southern雜交證實(shí)Ⅰ類整合子位于同樣大小的質(zhì)粒上。
　　 結(jié)論：