KLF4參與血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞骨架重構(gòu)的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞中與保持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)的纖維網(wǎng)絡(luò),包括微管、微絲和中間絲。細(xì)胞骨架不僅在維持細(xì)胞形態(tài),承受外力、保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性方面起重要作用,而且還參與許多重要的生命活動(dòng)。Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor,GKLF/KLF4)是KLFs家族中與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和癌癥發(fā)生密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。作為真核生物轉(zhuǎn)錄因子,KLF4主要分布在細(xì)胞核,參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育等重要的

2、生命過(guò)程,是體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞的重要誘導(dǎo)因子之一。目前對(duì)KLF4功能的研究往往局限在細(xì)胞核,關(guān)于KLF4在胞漿的分布及其功能尚鮮有報(bào)道。本文通過(guò)觀察KLF4與細(xì)胞骨架的相互作用,探討KLF4調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)的分子機(jī)制。
　　 方法:用貼塊法分離、培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞,胰蛋白酶消化傳代,取2～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞免疫熒光染色和Western blot分析觀察KLF4在細(xì)胞不同部位的分布;免疫共沉淀檢查KLF4與h

3、hLIM之間的相互作用;激光共聚焦顯微鏡觀察KLF4與細(xì)胞骨架的相互作用;鬼比環(huán)肽染色分析細(xì)胞骨架的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、PDGF-BB促進(jìn)KLF4核輸出
　　 細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示,在靜止的VSMCs中,KLF4主要在胞核中分布。PDGF-BB刺激VSMCs60 min后,KLF4在胞質(zhì)中的分布增加,刺激120 min后,KLF4在胞質(zhì)中的分布進(jìn)一步增加。Western blot結(jié)果顯示,隨著PD

4、GF-BB刺激VSMCs的時(shí)間的不斷延長(zhǎng),KLF4在胞質(zhì)中的分布明顯增加,呈時(shí)間依賴性,提示PDGF-BB促進(jìn)KLF4的核輸出。
　　 2、KLF4在胞質(zhì)中與細(xì)胞骨架相互作用
　　 免疫雙熒光分析結(jié)果顯示,在靜止的VSMCs中,FITC標(biāo)記的KLF4主要在胞核分布,與TRITC標(biāo)記的α-actin無(wú)明顯的熒光重疊,說(shuō)明KLF4不與actin相互作用。PDGF-BB刺激VSMCs60 min后,KLF4開(kāi)始從胞核向胞質(zhì)中轉(zhuǎn)

5、移,并與TRITC標(biāo)記的α-actin熒光相互重合為黃色熒光。免疫共沉淀結(jié)果表明,PDGF-BB處理前,在VSMCs的胞質(zhì)中,KLF4抗體不能與α-actin共沉淀,即沉淀物中沒(méi)有出現(xiàn)明顯的α-actin條帶,在給予PDGF-BB刺激后,沉淀物中出現(xiàn)清晰的α-actin條帶。提示,KLF4出核后在胞質(zhì)中以與α-actin相互締合的方式存在。
　　 3、KLF4參與細(xì)胞骨架重構(gòu)
　　 Western blot結(jié)果顯示,用細(xì)

6、胞骨架聚合劑(JPK)處理VSMCs后,KLF4在胞質(zhì)中的分布明顯增加;細(xì)胞松弛素(CB),使KLF4在胞質(zhì)中的分布明顯減少,提示,細(xì)胞骨架的重構(gòu)影響KLF4的亞細(xì)胞定位。
　　 用GFP-KLF4融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞后,給予PDGF-BB、CB、佛波酯(PMA)、JPK刺激,觀察其對(duì)細(xì)胞骨架重構(gòu)的影響。免疫熒光分析結(jié)果顯示,靜止期的NIH3T3細(xì)胞中含有大量平行束狀分布的應(yīng)力纖維。用PDGF-BB處理細(xì)胞后,束

7、狀分布的應(yīng)力纖維變少,肌絲排列為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);CB使細(xì)胞中的應(yīng)力纖維消失,微絲解聚,呈彌散狀分布于胞質(zhì)中。PMA使細(xì)胞中的應(yīng)力纖維形成podosome小體。JPK使細(xì)胞應(yīng)力纖維變的更加粗大。與未轉(zhuǎn)染組相比,KLF4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,經(jīng)PDGF-BB處理后,細(xì)胞束狀分布的應(yīng)力纖維無(wú)明顯減少,肌絲仍呈束狀排列;KLF4轉(zhuǎn)染后再經(jīng)CB處理時(shí),應(yīng)力纖維雖然也有解聚,但仍可見(jiàn)部分束狀排列的纖維,說(shuō)明KLF4對(duì)細(xì)胞骨架的解聚具有一定的抵抗作用;KLF4轉(zhuǎn)染

8、后再經(jīng)JPK處理時(shí),細(xì)胞的應(yīng)力纖維與未轉(zhuǎn)染組相比變的更加粗大;KLF4轉(zhuǎn)染后再經(jīng)PMA處理,podosome小體形成明顯減少,這些結(jié)果提示,KLF4參與了細(xì)胞骨架的重構(gòu)。
　　 4、KLF4通過(guò)與hhLIM相互作用促進(jìn)PDGF-BB介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重構(gòu)
　　 上述研究結(jié)果顯示,PDGF-BB可以促進(jìn)KLF4與actin相互作用,但KLF4無(wú)典型的actin結(jié)合結(jié)構(gòu)域,那么KLF4是否通過(guò)與actin結(jié)合蛋白hhLIM相互作

9、用參與細(xì)胞骨架重構(gòu)呢?為明確KLF4是否與hhLIM相互作用,我們檢測(cè)KLF4與hhLIM是否能夠免疫共沉淀。免疫共沉淀分析結(jié)果顯示,PDGF-BB促進(jìn)KLF4與hhLIM相互作用。上述結(jié)果說(shuō)明,KLF4通過(guò)hhLIM與細(xì)胞骨架相互作用并調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重構(gòu)。
　　 結(jié)論:
　　 1、PDGF-BB誘導(dǎo)KLF4出核,且KLF4在胞質(zhì)中與細(xì)胞骨架相互作用。
　　 2、KLF4參與細(xì)胞骨架的重構(gòu)。
　　 3、K