抗副豬嗜血桿菌單克隆抗體的制備和競爭ELISA方法的建立.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）是豬Glasser's病的病原菌，臨床上以纖維蛋白性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征。Hps是屬于巴斯德菌科嗜血桿菌屬的一種不運動、NAD依賴型、革蘭氏陰性細小桿菌。近年來，隨著我國規(guī)模化養(yǎng)豬場的發(fā)展，副豬嗜血桿菌感染有明顯增加趨勢，已成為豬場保育仔豬發(fā)病率和死亡率增加的重要原因之一，并給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。本文研制了抗副豬嗜血桿菌的單克隆抗體，并根據(jù)單抗建立了間接競

2、爭ELISA的檢測方法，對副豬嗜血桿菌的診斷和防制具有重要意義。
　　 本文分為兩部分。第一部分是抗副豬嗜血桿菌單克隆抗體的制備及其生物學(xué)特性鑒定，第二部分是應(yīng)用單抗建立間接競爭ELISA的試驗方法并對其反應(yīng)條件進行優(yōu)化。
　　 以純化的SW124全菌體免疫Balb/c小鼠，取脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，將提純的外膜蛋白作為篩選抗原包被酶標板，經(jīng)間接ELISA篩選，有限稀釋法3次克隆，獲得了3株穩(wěn)定分泌Ups單克隆

3、抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為2C6、4F10和5B9。3株單抗經(jīng)亞類鑒定試劑盒測定，所產(chǎn)生抗體均為IgG2b型，腹水ELISA效價分別為1∶3200，1∶12800和1∶5120。通過Western-blot證明2C6、4F10和5B9這三株單克隆抗體均是針對37kDa外膜蛋白的單抗，這些單抗的獲得為Hps的研究及快速診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　 選擇一株針對外膜蛋白且腹水效價較高的單抗(4F10)來建立快速檢測Ups抗體

4、的間接競爭ELISA方法。腹水單抗經(jīng)PEG沉淀法純化后，蛋白含量為4.16mg/mL。以SW124外膜蛋白為包被抗原，利用針對SW124外膜蛋白的單克隆抗體與Hps豬血清競爭該抗原，建立間接競爭ELISA方法檢測Hps抗體，優(yōu)化的反應(yīng)條件為:將SW124外膜蛋白作500倍稀釋后包被酶標板，單克隆抗體作1∶600稀釋，競爭反應(yīng)時間為1h，酶標抗體的工作濃度為1∶5000且作用時間也為1h，底物作用時間為10min，建立的間接競爭ELISA