NF-κB在鼠疫菌毒力蛋白YopE致病過程中作用機制的研究.pdf

1、YopE是鼠疫菌六種分泌蛋白之一，在鼠疫的致病過程中起重要作用。在宿主細胞內(nèi)，YopE作為GTP水解酶，通過其144位―精氨酸手指‖結(jié)構(gòu)與細胞膜藕聯(lián)蛋白RhoGTP酶相互作用使該酶由活性狀態(tài)轉(zhuǎn)化為非活性狀態(tài)，導致細胞骨架蛋白actin的降解，使感染細胞受損。如果將其144位的精氨酸突變?yōu)楸彼幔╕opE(R144A)）則YopE不具有GAP活性。
　　核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（Nuclearfactor-κB）是響應環(huán)境變化的一個至關(guān)

2、重要的轉(zhuǎn)錄因子，是進化上高度保守的信號模塊，廣泛存在于哺乳動物細胞中。在許多生物過程，如機體的炎癥反應、免疫反應、細胞分化與凋亡及其他應激反應等，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
　　本實驗室前期通過酵母雙雜交篩庫及陣列篩選發(fā)現(xiàn)YopE與p65存在相互作用，提示YopE與p65的相互作用可能在鼠疫菌的感染過程中起重要的作用。本研究通過免疫共沉淀，GST-PullDown實驗證明YopE與p65確實存在相互作用。GST-PullDown實驗確

3、定YopE與p65的相互作用結(jié)構(gòu)域為YopE(1-49aa、88-99aa)和p65(201-312aa)，其中YopE的88-99肽段在與p65的相互作用中起重要作用。報告基因?qū)嶒炞C明，轉(zhuǎn)染早期YopE以不依賴GAP活性方式顯著激活NF-κB通路。間接免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)YopE能促進p65入核。表達YopE上調(diào)NF-κB下游靶基因，其中明顯上調(diào)NF-κB下游的抗凋亡和炎癥反應基因。抑制NF-κB通路增加YopE誘導的細胞凋亡。機制上，我

4、們發(fā)現(xiàn)YopE能明顯促進p65與IκBα的解離。本文同時還構(gòu)建了YopE/YopE(R144A)的可誘導表達系統(tǒng)，并用該系統(tǒng)驗證了上述實驗結(jié)果。
　　此外，本文還采用可誘導表達系統(tǒng)研究了YopE/YopE(R144A)對HeLa細胞生物學特性的影響。發(fā)現(xiàn)YopE明顯抑制Rosup所引起的細胞ROS產(chǎn)生、阻滯細胞周期、促進p21蛋白表達。
　　綜上，本研究發(fā)現(xiàn)YopE通過與p65的相互作用促進NF-κB活化，并提高細胞的存活能