microRNA在砷致胚胎發(fā)育毒性中的作用機制研究.pdf

1、人群流行病學(xué)統(tǒng)計表明,長期暴露在含砷高的環(huán)境中,能導(dǎo)致生殖和胚胎發(fā)育異常,引起神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等出生缺陷。本研究以雞胚為動物模型進一步探討重金屬元素砷對胚胎發(fā)育影響的分子作用機制。我們首先應(yīng)用基因芯片篩選胚胎早期發(fā)育無機砷暴露組與正常對照組胚胎的差異mRNA和miRNA的表達譜,通過生物信息學(xué)分析差異microRNA與差異基因,構(gòu)建microRNA與差異基因功能間的相互作用網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果提示Nrp1、stmn1、HDAC4、Nrc

2、am等基因在microRNA介導(dǎo)的砷干擾胚胎發(fā)育中都發(fā)揮了重要作用,且其表達水平與相應(yīng)的microRNA表達呈負相關(guān)。我們的研究結(jié)果提示Nrp1基因位于mRNA和miRNA網(wǎng)絡(luò)圖的中心位置,可能是mir-181b和mir-9的一個作用靶點。神經(jīng)纖毛蛋白-1(Neuropilin-1,NRP-1)屬跨膜糖蛋白,作為軸突導(dǎo)向分子的受體,參與神經(jīng)導(dǎo)向的調(diào)節(jié),同時作為血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2)的共受體表達于血管內(nèi)皮細胞,參與血管新

3、生的調(diào)節(jié)。
　　 鑒于Nrp1基因在血管生成方面發(fā)揮著重要的作用,我們以人臍靜脈內(nèi)皮細胞株EAhy926為細胞模型,研究mir-181b、mir-9調(diào)控Nrp1表達在無機砷誘導(dǎo)的血管增生中的作用,研究結(jié)果提示EA.hy926細胞系暴露于無機砷環(huán)境下mir-181b、mir-9表達降低,Nrp1的表達增加,且呈劑量時間依賴關(guān)系。為了探討mir-181b、mir-9與Nrp1的調(diào)控關(guān)系,我們在EA.hy926細胞內(nèi)過表達和敲低mir

4、-181b和mir-9,研究表明過表達mir-181b和mir-9可以明顯降低Nrp1蛋白水平,敲低mir-181b和mir-9表達可以增加Nrp1蛋白的表達,結(jié)果提示mir-181b和mir-9可能作用于Nrp1的3’-UTR序列,調(diào)節(jié)其表達。為了進一步證明Nrp1的3’UTR.序列包含mir-181b和mir-9作用的位點,我們將Nrp1的3’-UTR序列克隆至螢光報告載體中,并與mir-181b和mir-9的模擬物與抑制物共轉(zhuǎn)染至

5、EA.hy926細胞中,然后檢測螢光素酶的活性,結(jié)果表明mir-181b和mir-9的過表達可以明顯抑制螢光素酶的活性；與之相反,當(dāng)我們將包含Nrp1的3’-UTR序列的螢光素酶報告載體中mir-181b和mir-9可能的結(jié)合位點剪切或突變以后,再和mir-181b和mir-9的模擬物與抑制物共轉(zhuǎn)染至EA.hy926細胞中,螢光素酶的活性僅發(fā)生微弱的變化,這說明mir-181b和mir-9可以直接作用于Nrp1的3’UTR區(qū)調(diào)控其表達。

6、
　　 細胞遷移實驗和血管生成實驗?zāi)軌蛴行гu估測定離體血管生成,我們通過細胞遷移實驗和血管生成實驗證明無機砷通過miRNA介導(dǎo)的Nrp1表達上升促進血管生成。結(jié)果提示細胞暴露在砷環(huán)境中內(nèi)皮細胞的遷移數(shù)和小管生成數(shù)增加,與對照組比較,有顯著性差異。而轉(zhuǎn)染mir-181b和mir-9模擬物后過表達mir-181b和mir-9的細胞在暴露于砷環(huán)境中內(nèi)皮細胞的遷移數(shù)和小管生成數(shù)與對照組相比無顯著性差異,提示過表達mir-181b和mir