葛根異黃酮抑制血管平滑肌細胞增殖作用機制的實驗研究.pdf

1、目的 動脈粥樣硬化和經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)后(percutaneous transluminal coronary angioplast,PTCA)再狹窄與平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)過度增殖有關(guān).葛根異黃酮是自豆科植物野葛干燥根的提取物的成分,主要有效成分為4,7-二羥基8-β-D葡萄糖異黃酮(葛根素)和4,7-二羥基異黃酮(大豆苷元).葛根素可以抑制兔主動脈SMC增生,促進其凋亡;大豆苷

2、元能夠抑制多種腫瘤細胞系的增生,抑制SHRSP大鼠主動脈平滑肌細胞的增生及DNA的合成.該課題意圖通過體外細胞實驗證實葛根素和大豆苷元抑制人臍動脈平滑肌細胞(Human umbilical Arterial smooth muscle cell,HUASMC)增殖的藥效并從基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達等角度探討其機制,為葛根素和大豆苷元預防此類疾病提供理論依據(jù).方法 1.葛根素和大豆苷元對HUASMC增殖的抑制作用:體外培養(yǎng)HUASMC,設(shè)立空白

3、對照組及不同濃度葛根素和大豆苷元組,MTT法檢測細胞生長活性,細胞生長曲線檢測細胞倍增狀態(tài),確定最佳藥物作用濃度及時間.2.差異篩選葛根素和大豆苷元抑制HUASMC增殖的相關(guān)基因:體外培養(yǎng)細胞,給予葛根素和大豆苷元刺激,提取細胞總RNA,進行DD-PCR反應,篩選差異片斷.3.克隆差異片斷:擴增差異片斷并純化,通過T4連接酶將PCR產(chǎn)物與pGEMT載體相連,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細菌JM109,篩選并鑒定陽性重組子,測序并Genbank檢索.選擇

4、奢侈基因進一步研究.4.目的基因在HUASMC中表達的鑒定:培養(yǎng)HUASMC并給予葛根素和大豆苷元刺激,提取細胞總RNA,進行競爭性反轉(zhuǎn)錄PCR.5.蛋白表達及純化:根據(jù)差異基因編碼序列設(shè)計引物,以全長cDNA為模板進行PCR擴增,與pET32a載體連接,轉(zhuǎn)化入Origami(DE3),0.25mM IPTG誘導蛋白表達,使用Ni-NTA His Band Resins純化蛋白,腸激酶酶切融合蛋白,12％SDS-PAGE電泳,考馬斯亮蘭