血紅素氧合酶-1對(duì)大鼠肝移植缺血再灌注損傷防護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝臟移植(Livertransplantation，LTx)已成為終末期肝臟疾病的首選治療方法。然而，盡管在手術(shù)技術(shù)、器官保存和免疫抑制方面已經(jīng)取得較大進(jìn)展，但原發(fā)性移植肝無(wú)功能(primarynon-function，PNF)和移植肝早期失功能依然是影響原位肝移植效果的重要因素。有5％～15％的患者因原發(fā)性移植肝無(wú)功能而導(dǎo)致移植肝功能衰竭而被迫再移植，同時(shí)還有10％～25％的患者移植后早期出現(xiàn)移植肝功能紊亂。研究表明，移植肝缺血再灌注

2、損傷是其重要原因，其不僅可使肝代謝解毒能力降低、微循環(huán)阻力升高，嚴(yán)重者還可導(dǎo)致肝功能衰竭。因此，減輕移植肝的缺血再灌注損傷是提高供肝質(zhì)量，減少PNF的發(fā)生，提高移植成功率的重點(diǎn)。 血紅素氧合酶(hemeoxygenase，HO)是一種催化血紅素降解為一氧化碳(carbonmonoxide，CO)、鐵和膽紅素的起始酶和限速酶。HO-1為誘導(dǎo)型，亦稱熱休克蛋白32(HSP32)。已證實(shí)HO-1是一種應(yīng)激蛋白，重金屬、熱休克、谷胱甘肽

3、耗竭、紫外線、內(nèi)毒素、缺血再灌注、缺氧、高氧等多種因素均可誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，外源性HO-1表達(dá)上調(diào)具有重要的抗炎癥和抗氧化作用，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化、妊高癥、肺動(dòng)脈高壓、組織損傷以及缺血再灌注損傷等具有防護(hù)作用，但關(guān)于其在肝移植缺血再灌注損傷中作用的研究尚較少見(jiàn)。因此，研究HO-1對(duì)肝移植缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制將為臨床肝移植缺血再灌注損傷的防護(hù)提供一條新的思路。 目的： 通過(guò)建立大鼠同種異體原位肝移植模

4、型，應(yīng)用HO-1的特異性誘導(dǎo)劑鈷原卟啉和抑制劑鋅原卟啉對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行預(yù)處理，觀察其對(duì)移植肝缺血再灌注損傷的影響，并探討其可能機(jī)制，為臨床肝移植缺血再灌注損傷的防治提供一種可能的方法。 材料和方法： Wistar大鼠96只，體重200～250g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)取6只為正常對(duì)照組(C組)，另90只隨機(jī)分為三組，即實(shí)驗(yàn)1組(S1組)、實(shí)驗(yàn)2組(S2組)和實(shí)驗(yàn)3組(S3組)，每組30只。各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取供受體各12只

5、，供體在藥物預(yù)處理24h后行供肝切除術(shù)，其余6只作為供體僅行藥物預(yù)處理。各組預(yù)處理方法為：S1組按5ml/Kg經(jīng)腹腔注射生理鹽水，S2組按5mg/Kg注射鈷原卟啉，S3組按1.5mg/Kg注射鋅原卟啉。各實(shí)驗(yàn)組均建立大鼠同種異體原位肝移植模型，4℃UW液灌注供肝至發(fā)白，切除供肝置于4℃UW液中保存，4h后行肝移植。各組分別在供體藥物預(yù)處理后24h、移植肝門靜脈復(fù)流后1h和3h自下腔靜脈抽取血樣，全自動(dòng)分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(al

6、anineaminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotranferase，AST)的水平，放射免疫法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子-a(tumornecrosisfactor-alpha，TNF-a)水平；切取部分肝臟組織，行HE染色觀察病理變化、免疫組織化學(xué)檢測(cè)HO-1蛋白的表達(dá)、RT-PCR法檢測(cè)HO-1mRNA的表達(dá)。C組不行肝移植，開(kāi)腹后直接抽取下腔靜脈血及切取肝臟組織。記錄供肝冷缺血時(shí)間

7、，受體無(wú)肝期和受體手術(shù)時(shí)間。應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析、單因素方差分析和t檢驗(yàn)對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，取a=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果： (1)三組之間供肝冷缺血時(shí)間、受體無(wú)肝期和受體手術(shù)時(shí)間比較，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。 (2)與正常對(duì)照組相比，在供體預(yù)處理后24h，各實(shí)驗(yàn)組血清ALT水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；移植肝門靜脈復(fù)流后1h，各實(shí)驗(yàn)組血清ALT水平較

8、移植前明顯升高，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，差異有顯著性(P＜0.05)；在門靜脈復(fù)流后1h和3h，S2組血清ALT水平明顯低于S1組(P＜0.05)和S3組(P＜0.05)，S1明顯低于S3組，差異有顯著性(P＜0.05)。 (3)與正常對(duì)照組相比，在供體預(yù)處理后24h，各實(shí)驗(yàn)組血清AST水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；移植肝門靜脈復(fù)流后1h，各實(shí)驗(yàn)組血清AST水平較移植前明顯升高，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，差異有顯著性(P＜0.

9、05)；在移植肝門靜脈復(fù)流后1h和3h，S2組血清AST水平明顯低于S1組(P＜0.05)和S3組(P＜0.05)，S1明顯低于S3組，差異有顯著性(P＜0.05)。 (4)與正常對(duì)照組相比，在供體預(yù)處理后24h，各實(shí)驗(yàn)組血清TNF-a水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；移植肝門靜脈復(fù)流后1h，各實(shí)驗(yàn)組血清TNF-a水平較移植前明顯升高，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，差異有顯著性(P＜0.05)；在移植肝門靜脈復(fù)流后1h和3h，S2組血

10、清TNF-a水平明顯低于S1組(P＜0.05)和S3組(P＜0.05)，S1明顯低于S3組，差異有顯著性(P＜0.05)。 (5)供體預(yù)處理后24h，S2組即有HO-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)，位于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞，棕黃色顆粒散在于胞漿中，S1組和S3組只有極少量表達(dá)，C組則無(wú)表達(dá)，差異有顯著性(P＜0.05)；移植肝門靜脈復(fù)流后1h，各實(shí)驗(yàn)組HO-1蛋白表達(dá)水平較移植前明顯升高，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，差異有顯著性(P＜0

11、.05)；在移植肝門靜脈復(fù)流后1h和3h，S2組HO-1蛋白表達(dá)水平明顯高于S1組(P＜0.05)和S3組(P＜0.05)，S1組明顯高于S2組，差異有顯著性(P＜0.05)。 (6)供體預(yù)處理后24h，S2組可見(jiàn)肝臟組織中HO-1mRNA有較高表達(dá)，S1組和S3組只有極少量表達(dá)，C組無(wú)表達(dá)，差異有顯著性(P＜0.05)；移植肝門靜脈復(fù)流后1h，各實(shí)驗(yàn)組HO-1mRNA水平較移植前明顯升高，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，差異有顯著性(

12、P＜0.05)；在移植肝門靜脈復(fù)流后1h和3h，S2組HO-1mRNA表達(dá)水平明顯高于S1組(P＜0.05)和S3組(P＜0.05)，S1明顯高于S3組，差異有顯著性(P＜0.05)。 (7)HE染色發(fā)現(xiàn)，光鏡下各組在供體預(yù)處理后24h肝臟結(jié)構(gòu)正常；移植肝門靜脈復(fù)流后3h，S1組可見(jiàn)小片肝細(xì)胞中度濁腫，水泡樣變性，肝索增寬，肝血竇縮??；S2組僅出現(xiàn)肝竇輕度擴(kuò)張；S3組可見(jiàn)肝索增寬，肝血竇變窄，大片肝細(xì)胞嚴(yán)重水泡樣變性，部分氣球樣