宮頸癌及其前期病變HPV感染與基因型分布及HPV16癌基因轉(zhuǎn)錄水平沉默的研究.pdf

1、研究背景：　　宮頸癌是女性第二大常見(jiàn)的惡性腫瘤，是嚴(yán)重威脅我國(guó)女性健康的疾病。在所有惡性腫瘤中，宮頸癌的發(fā)病因素最為明確，高危人乳頭瘤病毒(HPV)感染是關(guān)鍵和必要的致病因素。宮頸癌明確的致病因素和緩慢的發(fā)病過(guò)程為宮頸癌的防治提供了寶貴時(shí)機(jī)。 在所有HPV基因型中，目前已明確有15個(gè)型與宮頸癌相關(guān)，屬于高危型，但仍有多個(gè)HPV基因型因感染率較低，其危險(xiǎn)度的確定仍有待于進(jìn)一步的研究。已知HPV基因型分布具有地區(qū)差異，但國(guó)內(nèi)HPV

2、基因型分布的數(shù)據(jù)較少，浙江省尚無(wú)報(bào)道。在HPV基因型的檢測(cè)方法上，雖然方法種類(lèi)多，但仍存在各種問(wèn)題，如不能區(qū)分具體基因型(如雜交捕獲法)，靈敏度低(southern blot)，覆蓋的基因型較少(PCR-雜交法)，價(jià)格昂貴(基因芯片法)等。因此，建立一種合適的HPV基因型檢測(cè)方法，檢測(cè)并確定來(lái)自浙江省的宮頸癌及其前期病變患者感染的主要HPV基因型具有非常重要的意義。 宮頸癌的疫苗已取得了重大進(jìn)展，但是由于疫苗是通過(guò)預(yù)防HPV感染

3、進(jìn)而預(yù)防宮頸癌的發(fā)生，而HPV高感染率高自然清除率的特點(diǎn)使價(jià)格昂貴的疫苗難以在中國(guó)婦女中進(jìn)行普及。在中國(guó)更現(xiàn)實(shí)可行的方法是通過(guò)治療高危HPV持續(xù)感染來(lái)預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。新興的RNA干擾(RNAi)技術(shù)為高危HPV持續(xù)感染癌基因的阻斷治療提供了新的手段。目前RNAi在宮頸癌上的研究基本集中在HPV E6/E7轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。但由于病毒特有變異能力，探索多個(gè)途徑基因沉默的研究非常重要。最新研究發(fā)現(xiàn)，RNAi也可在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用，與啟

4、動(dòng)子同源的siRNA可通過(guò)DNA甲基化及其他表觀遺傳學(xué)機(jī)制使下游基因表達(dá)沉默。HPV16癌基因E6和E7具有共同的啟動(dòng)子，為RNAi在轉(zhuǎn)錄水平同時(shí)沉默E6和E7轉(zhuǎn)錄提供了可行性，但迄今尚未見(jiàn)利用RNAi對(duì)HPV病毒基因在轉(zhuǎn)錄水平沉默的研究報(bào)道。由于RNAi轉(zhuǎn)錄水平的作用機(jī)制涉及DNA甲基化，因此也有必要了解不同宮頸HPV感染狀態(tài)(HPV感染的宮頸癌及其前期病變、單純感染)下HPV16關(guān)鍵調(diào)控區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)，探索其在宮頸癌發(fā)生過(guò)程中

5、的意義，也有助于為干擾靶點(diǎn)的選擇提供指導(dǎo)價(jià)值。因此，本研究擬建立一種覆蓋HPV基因型廣、性?xún)r(jià)比高的HPV基因型檢測(cè)方法，對(duì)來(lái)自浙江省官頸癌及其癌前病變患者的HPV基因型進(jìn)行檢測(cè)，確定浙江省宮頸癌及其癌前病變患者的主要HPV基因型；對(duì)最常見(jiàn)的基因型HPV16，通過(guò)宮頸癌及其前期病變和單純感染中HPV16主要調(diào)控區(qū)DNA甲基化的檢測(cè)，明確DNA甲基化狀態(tài)在宮頸癌變過(guò)程中的意義；在此基礎(chǔ)上，利用小干擾RNA靶向HPV16啟動(dòng)子區(qū)在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)

6、癌基因E6/E7的基因沉默，以探索HPV16癌基因沉默的新途徑。 第一部分　一種HPV基因型檢測(cè)方法的建立 目的： 建立一種生殖道HPV基因型的檢測(cè)方法 方法： 針對(duì)各生殖道HPV基因型的序列，選擇合適的限制性?xún)?nèi)切酶，設(shè)計(jì)PCR產(chǎn)物的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP法)，以雜交捕獲法(HCⅡ)檢驗(yàn)該方法的敏感性，用測(cè)序法檢驗(yàn)該方法的準(zhǔn)確性。 結(jié)果： 建立了一種檢測(cè)生殖道H

7、PV基因型的PCR-RFLP法，建立各常見(jiàn)基因型的酶切圖譜。PCR-RFLP和HCⅡ法HPV檢測(cè)的符合率為92.4％。PCR-RFLP法判定的HPV基因型均與測(cè)序法檢測(cè)的結(jié)果一致。 結(jié)論： PCR-RFLP法檢測(cè)生殖道HPV感染基因型準(zhǔn)確性高、覆蓋基因型廣、性?xún)r(jià)比好，可用于HPV基因型的檢測(cè)。 第二部分　宮頸癌及其前期病變的HPV感染及其基因型分布 目的： 了解來(lái)自浙江省的宮頸癌及其前期病變患者的

8、HPV感染及其基因型的分布情況 方法： 以2004年5月至2006年4月間在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院以官頸疾病就診的患者為研究對(duì)象，用PCR-RFLP法檢測(cè)HPV基因型的感染情況。共成功檢測(cè)了631例官頸癌及其前期病變患者，其中宮頸癌(181例)、CIN Ⅱ-Ⅲ(345例)、CIN Ⅰ(105例)。以217例年齡配對(duì)的無(wú)細(xì)胞學(xué)異常者作為對(duì)照。 結(jié)果： 宮頸癌中HPV的感染率為95.0％，CIN Ⅱ-Ⅲ

9、中感染率為88.4％，而CINⅠ中的感染率為73.3％。在宮頸癌及其前期病變中共檢測(cè)到24型HPV。在宮頸癌中主要的基因型為HPV16，HPV18和HPV58；而在CIN中主要基因型為HPV16，HPV58，HPV33和HPV18。HR-HPV與LR-HPV的比例隨著CIN級(jí)別的增加直至宮頸癌逐漸增加。HPV16的構(gòu)成比亦隨CIN級(jí)別的增加直至宮頸癌逐漸增加。 結(jié)論： 1.宮頸癌HPV的感染率為95.0％，CIN Ⅱ-Ⅲ

10、 88.4％，CIN Ⅰ 73.3％提示浙江省宮頸癌及其前期病變的HPV感染率高于中國(guó)其他地區(qū)。 2.宮頸癌主要的基因型為HPV16，HPV58，HPV18，CIN主要的基因型為HPV16，HPV58，HPV33和HPV18，提示除HPV16和18以外，浙江省宮頸癌及其前期病變的主要基因型為HPV58，可能也包括HPV33。 第三部分　宮頸癌及其前期病變和單純感染中HPV 16長(zhǎng)控制區(qū)的甲基化檢測(cè) 目的：

11、 獲得HPV16 LCR關(guān)鍵區(qū)域的詳細(xì)甲基化信息，探索HPV16 LCR區(qū)甲基化在不同宮頸HPVl6感染狀態(tài)中的意義。 方法： 采用亞硫酸氫修飾后焦磷酸測(cè)序法，檢測(cè)了70例臨床宮頸標(biāo)本的HPV16的甲基化狀態(tài)，包括26例宮頸癌，13例高度宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN Ⅲ)，17例中低度官頸上皮內(nèi)瘤變(CIN Ⅰ-Ⅱ)和14例單純感染者。 結(jié)果： HPV16 LCR總體甲基化狀態(tài)顯示官頸癌和HPV16單純感染中H

12、PV16LCR區(qū)的甲基化相對(duì)多見(jiàn)。HPV16LCR關(guān)鍵區(qū)域八個(gè)CpG位點(diǎn)的詳細(xì)甲基化狀態(tài)顯示啟動(dòng)子區(qū)的甲基化較增強(qiáng)子多見(jiàn)。 結(jié)論： 1.與單純感染相比，CIN中HPV16 LCR呈去甲基化狀態(tài)，提示LCR去甲基化與宮頸瘤變的起始階段相關(guān)。 2.在宮頸癌中HPV16 LCR呈相對(duì)高甲基化，可能是宿主細(xì)胞防御病毒癌基因表達(dá)的反映。 3.HPV16 LCR啟動(dòng)子區(qū)的甲基化檢出率和CpG位點(diǎn)的甲基化頻率高于增強(qiáng)子

13、區(qū)，提示啟動(dòng)子區(qū)甲基化在調(diào)節(jié)病毒基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮更重要作用。 第四部分　siRNA靶向HPV16啟動(dòng)子區(qū)誘導(dǎo)癌基因E6/E7的基因沉默 目的： 探索HPV16癌基因在轉(zhuǎn)錄水平沉默的途徑方法：設(shè)計(jì)靶向HPV16 E6/E7啟動(dòng)子區(qū)的siRNA，并將siRNA轉(zhuǎn)染入宮頸癌細(xì)胞株SiHa中，觀察癌基因E6和E7的表達(dá)情況，細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡情況，以及HPV16啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化情況。 結(jié)果： E6