紅小豆鐵蛋白基因的克隆及在水稻中的轉(zhuǎn)化.pdf

1、本研究應(yīng)用快速擴增cDNA末端技術(shù)(rapidamplificationcDNAends，簡稱RACE，下同)，克隆得到紅小豆鐵蛋白基因的cDNA序列；對RACE技術(shù)進行了探討和改進。應(yīng)用基因槍轉(zhuǎn)化法將該鐵蛋白基因的編碼區(qū)(CDS)轉(zhuǎn)入水稻中，為培育含鐵量高的轉(zhuǎn)基因水稻，提高水稻的營養(yǎng)品質(zhì)，解決人類的鐵缺乏癥提供一條方便、經(jīng)濟、有效的途徑。主要研究結(jié)果如下：　　1、根據(jù)現(xiàn)有的大豆、豌豆等十幾種植物鐵蛋白基因的同源序列，設(shè)計簡并引物，應(yīng)

2、用3'RACE擴增出紅小豆鐵蛋白基因cDNA的3'端序列，通過三次5'RACE擴增5'端序列，得到了紅小豆鐵蛋白基因cDNA，長度為1030bp，得到了完整的編碼序列為768bp，共編碼255個氨基酸。　　2、通過反轉(zhuǎn)錄后回收較大分子量DNA后再用連接酶環(huán)化的策略，減輕了利用TaKaRa公司5'RACE試劑盒擴增基因5'端時，常常出現(xiàn)小片段之間重組問題的影響，提高了擴增成功的機率，為利用RACE克隆新基因提供了技術(shù)支持?！　?、以R

3、ACE擴增得到的紅小豆鐵蛋白基因的CDS作為目的片段，連接含有玉米泛素啟動子的1301載體，構(gòu)建成pCambia1301-UbiN-AFerCDS植物表達載體。　　4、采用基因槍轉(zhuǎn)化法，將含有紅小豆鐵蛋白基因的pCambia1301-UbiN-AFerCDS植物表達載體轉(zhuǎn)入水稻中。對轉(zhuǎn)基因水稻葉片進行PCR檢測和鐵含量測定，證明目的片段已經(jīng)整合到水稻基因組中。　　5、應(yīng)用濕灰法對轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的鐵含量進行測定，轉(zhuǎn)基因植株葉片的鐵含