兒童結(jié)核性腦膜炎腦脊液蛋白質(zhì)組學的初步研究.pdf

1、目的：結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TM)是小兒時期一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病。其病死率為20﹪～50﹪，幸存者中有20﹪～30﹪留有永久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。TM發(fā)病機制尚不完全清楚，診斷困難，預斤較差。蛋白質(zhì)組學技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種研究特定細胞、組織或完整生物體所表達的全部蛋白質(zhì)及其活動規(guī)律的新興學科。本實驗通過該技術(shù)建立正常中國兒童及TM患兒腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)

2、蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜，篩選TM特異性蛋白，為TM的早期診斷提供線索，同時也為其發(fā)病機制的深入了解提供新思路。 方法：收集TM急性期、TM治療1個月后及正常對照組兒童CSF各5ml，三氯乙酸(trichloracetic acid，TCA)沉淀法獲取CSF總蛋白質(zhì)，固相PH梯度(immobile PH gradient，IPG)二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(two-dimensional polyacrylamide gel elec

3、trophoresis，2D-PAGE)技術(shù)分離蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍染色，Imagescanner掃描儀以及LabScan掃描軟件對凝膠進行掃描獲取圖像。利用圖像分析軟件PDQuest 7.0，以正常兒童CSF的2-DE凝膠為參考膠，將TM急性期CSF的凝膠與之進行比較分析，尋找兩組CSF蛋白質(zhì)譜的異常變化斑點。再以TM急性期CSF凝膠為參考膠，將TM治療1個月后CSF凝膠與之比較分析，觀察差異蛋白質(zhì)斑點的變化情況。篩選出分辨清楚、僅在T

4、M急性期CSF中表達的蛋白質(zhì)斑點，切取后進行基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization timeof flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting，PMF)，運用生物信息學技術(shù)獲取蛋白的基本信息，確定差異蛋白質(zhì)。 結(jié)果：正常兒童CSF分離獲

5、得蛋白質(zhì)斑點533個，TM急性期CSF分離獲得蛋白質(zhì)斑點546個，其中有14個蛋白質(zhì)點僅在正常CSF表達，27個蛋白質(zhì)點僅在TM急性期CSF中表達，在TM急性期高豐度表達的蛋白質(zhì)點，在TM治療1個月后CSF中表達量均下調(diào)。與正常CSF蛋白質(zhì)點表達量比較，TM急性期有15個蛋白質(zhì)點表達量有2倍以上的上調(diào)，而8個蛋白質(zhì)點表達量有2倍以上的下調(diào)。共選出20個差異蛋白質(zhì)點進行MALDI-TOF-MS分析，獲得了20張PMF。進入數(shù)據(jù)庫進行搜索后

6、匹配到蛋白質(zhì)的點有16個，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A-I、免疫球蛋白J鏈、人多克隆免疫球蛋白M冷凝集素Fab片段、免疫球蛋白λ輕鏈VLJ區(qū)、MGC3 1936蛋白、免疫球蛋白九輕鏈可變區(qū)、抗腫瘤壞死因子α抗體、免疫球蛋白G1 A鏈Fab片段、免疫球蛋白KC、HLA-Ⅱ類抗原DRB1-4、PRO2675蛋白、MRP14蛋白在TM。急性期CSF中特異性表達。 結(jié)論：本實驗首次成功建立了正常兒童CSF與TM患兒CSF的雙向凝膠電泳圖譜。通過凝膠圖