早期自然流產(chǎn)蛻膜組織基因表達譜和蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、正常蛻膜組織是母一胎界面間一個非常復(fù)雜而又高度協(xié)調(diào)的微環(huán)境，它由多種細(xì)胞如侵襲至蛻膜的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(eXtravilloustrophoblast，EVT)、子宮內(nèi)膜源性細(xì)胞(如上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞)、骨髓源性細(xì)胞(如大顆粒淋巴細(xì)胞、蛻膜巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和少許B細(xì)胞)構(gòu)成，這些細(xì)胞以及由這些細(xì)胞、母體和胎兒所分泌到蛻膜的細(xì)胞因子共同形成了母-胎間信息交流的平臺，并對胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞“有控性”侵襲、子宮內(nèi)膜的免疫容受性、蛻膜化和胎盤的形成

2、進行精細(xì)的調(diào)控。一旦蛻膜組織的這種精細(xì)調(diào)控失去平衡，如某些基因的表達變化或某種細(xì)胞因子發(fā)生變化(如基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs與其抑制劑TIMPs表達失去平衡)，蛻膜組織微環(huán)境的精細(xì)調(diào)控就會被打破，母體就會對胎兒產(chǎn)生排斥反應(yīng)，導(dǎo)致胚胎流產(chǎn)。 早期自然流產(chǎn)是指在娠妊12周之前非故意終止的宮內(nèi)妊娠，是臨床常見的病理妊娠之一，其發(fā)生率占全部自然流產(chǎn)的62％以上。在這些流產(chǎn)病例中，相當(dāng)一部分的流產(chǎn)動病因不明。近年來，隨著子宮內(nèi)膜容受性、蛻膜組

3、織病理學(xué)研究表明，胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞有控性侵襲子宮內(nèi)膜是胚胎正常發(fā)育的基礎(chǔ)，而這種機制的形成正是以子宮內(nèi)膜正常蛻膜化為前提。而早期自然流產(chǎn)的蛻膜組織，其蛻膜微環(huán)境發(fā)生了哪些變化?這些變化與自然流產(chǎn)的內(nèi)在聯(lián)系如何?以往人們一直試圖從蛻膜組織中某一特定的基因或蛋白作為突破口，探尋其與自然流產(chǎn)發(fā)生的關(guān)系，但多是從單一基因或單一蛋白分子的角度去研究，而從基因表達譜或蛋白質(zhì)組學(xué)整體水平變化上去探尋自然流產(chǎn)的病因尚未見報道。目前，大規(guī)模的基因表達譜和蛋白

4、質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域，其中寡核苷酸芯片、DNA微陣列以及基因表達系列分析是應(yīng)用最為廣泛和最有效的基因表達分析技術(shù)。 目前已有的人類全基因組芯片U133 plus2.0，包含了39000個轉(zhuǎn)錄本，代表了33000個人類明晰的基因，由A和B兩張芯片組成，包括100多萬個探針矩陣，序列來源于GenBank,dbEST,refseq數(shù)據(jù)庫。利用U133 plus2.0芯片，可以高通量地對自然流產(chǎn)蛻膜的基因表達變化進

5、行分析。而二維電泳(two-dimensional gel electrophoresis)和質(zhì)譜(mass spectrometry)技術(shù)，主要用于研究基因轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)的表達水平、氨基酸序列和修飾方式等。因此，我們借助于基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，分析了自然流產(chǎn)蛻膜組織的基因表達變化和基因轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)的表達變化，獲得了自然流產(chǎn)蛻膜組織細(xì)胞的基因表達譜和蛋白表達譜，為探索自然流產(chǎn)的分子基礎(chǔ)和可能的發(fā)生機制以及自然流產(chǎn)的病因診斷、預(yù)防和

6、治療奠定了重要的實驗基礎(chǔ)。 通過人類全基因組芯片U133 plus2.0分析，我們觀察到了自然流產(chǎn)蛻膜組織中1876個基因表達的變化，其中基因表達上調(diào)的1004個，下調(diào)的872個。對1876個差異表達基因進行生物學(xué)功能檢索發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因上調(diào)37個、下調(diào)32個；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因上調(diào)83個、下調(diào)47個；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因上調(diào)71個、下調(diào)59個；細(xì)胞生長/維持相關(guān)基因上調(diào)85個、下調(diào)88個；代謝相關(guān)基因上調(diào)103個、下調(diào)86個

7、；凋亡相關(guān)基因上調(diào)55個、下調(diào)27個；物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)基因上調(diào)67個、下調(diào)77個；細(xì)胞周期相關(guān)基因上調(diào)21個、下調(diào)23個；應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因上調(diào)9個、下調(diào)3個；細(xì)胞防御反應(yīng)相關(guān)基因上調(diào)28個、下調(diào)7個；免疫應(yīng)答相關(guān)基因上調(diào)41個、下調(diào)25個；細(xì)胞黏附相關(guān)基因上調(diào)3 1個、下調(diào)47個；發(fā)育相關(guān)基因上調(diào)81個、下調(diào)85個。此外，通過檢索，我們發(fā)現(xiàn)有558個基因尚無功能描述，其中上調(diào)293個、下調(diào)265個。對1318個已知功能基因進行了Pathwa

8、y分析，發(fā)現(xiàn)主要涉及MAPK、ERK、P38、Jak-STAT、Natural killer cell mediatedcytotoxicity、mTOR、Apoptosis等信號通路。經(jīng)過對基因芯片結(jié)果進行生物信息學(xué)綜合分析，我們認(rèn)為自然流產(chǎn)蛻膜組織涉及多基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，其中細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答、水解酶等相關(guān)基因表達上調(diào)，以及細(xì)胞粘附相關(guān)基因表達下調(diào)可能是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的主要因素。 2-DE圖譜顯示，自然流產(chǎn)蛻膜組織蛋白質(zhì)分子量(Mw)主要

9、集中在14-116 KDa范圍內(nèi)，等電點(pI)主要分布在pH 4.0-8.0之間。PDQuest軟件分析2-DE圖像，得到正常蛻膜和自然流產(chǎn)蛻膜組織蛋白點分別為613個和583個。以正常蛻膜為參照，自然流產(chǎn)蛻膜的蛋白點與其匹配率為78％，表達差異的蛋白點有73個(上調(diào)38個，下調(diào)35個)，其中蛋白表達上調(diào)3倍以上的蛋白點有23個，下調(diào)3倍以上的點有17個；僅在自然流產(chǎn)蛻膜中表達的蛋白點有22個，僅在正常蛻膜中表達的蛋白點有19個。對1

10、5個差異顯著的蛋白點進行MALDI-TOF-MS鑒定，經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢，9個蛋白點獲得了有意義的結(jié)果(p<0.05)：1，2號均為波形蛋白Vimentin，4號為鈣網(wǎng)織蛋白前體(Calreticulin precursor，CRP55)，7號為膜聯(lián)蛋白A5(Annexin A5)，8號為原肌球蛋白-4(Tropomyosin alpha-4)；11號為Endoplasmin precursor (glucoseregulated prote

11、in Grp94)，12號為蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3前體(Proteindisulfide-isomerase A3 precursor)，14號為膜聯(lián)蛋白A1(Phospholipase A2inhibitory protein，Annexin A1)，15號為α-烯醇化酶(α-enolase)。其中1、2、7、14、15號蛋白表達增加，8、11、12蛋白表達下降，4號蛋白僅在自然流產(chǎn)的蛻膜組織中表達。通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定出的這些差異蛋白質(zhì)

12、，其功能涉及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、自然流產(chǎn)蛻膜組織血管的重建及蛻膜細(xì)胞的凋亡等。我們對基因芯片中高表達(Signal Log Ratio=5.5)的基質(zhì)金屬蛋白酶10(MMP10)進行了初步的功能學(xué)研究。 結(jié)果 發(fā)現(xiàn)MMP10在自然流產(chǎn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中表達較高，而在正常蛻膜組織中表達較低，在細(xì)胞核已經(jīng)發(fā)生濃縮裂解的流產(chǎn)蛻膜組織細(xì)胞中，其胞漿為陰性，在Transwll實驗中MMP10還能促進絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(HPT-8)的侵襲。