外源谷胱甘肽促進(jìn)牛體外受精胚胎發(fā)育的機(jī)制.pdf

1、在胚胎的體外培養(yǎng)過程中會(huì)有氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，正常情況下胞內(nèi)產(chǎn)生和清除ROS的量會(huì)維持平衡狀態(tài)，然而這種狀態(tài)一旦遭到破壞就會(huì)使胞內(nèi)積累過多的ROS，過量的ROS會(huì)損傷細(xì)胞，影響胚胎的發(fā)育能力?？寡趸瘎┕入赘孰模╣lutathione，GSH）能清除 ROS，由 ROS帶來的氧化應(yīng)激不能損傷到胚胎，最終對(duì)胚胎的體外發(fā)育和胚胎質(zhì)量都能有所提高。然而，外源 GSH如何進(jìn)入體外培養(yǎng)的胚胎內(nèi)，

2、并有效清除 ROS的機(jī)制并不清楚，因此本文采用胚胎工程、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法揭示外源GSH的轉(zhuǎn)運(yùn)及其對(duì)胞內(nèi) ROS的作用機(jī)制，及 GSH處理對(duì)胚胎轉(zhuǎn)錄組水平的影響，為胚胎體外生產(chǎn)效率的提高提供理論基礎(chǔ)。
　　牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中添加3毫摩爾每升（mmol/L，mM）GSH后繼續(xù)培養(yǎng)到7天，分別統(tǒng)計(jì)各階段的胚胎發(fā)育率及囊胚總細(xì)胞數(shù)；同時(shí)，測(cè)定受精后8h、18h、24h和32h胚胎內(nèi)的ROS和GSH含量。采用酶聯(lián)免疫

3、測(cè)定受精后8h、18h、24h和32h胚胎中GSH運(yùn)輸和再合成相關(guān)酶（GGT、GGT、5-OPase、GCLC、GCLM和GSS）的活性，及其在基因的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果，GSH添加后，卵裂率及囊胚率明顯提高；細(xì)胞內(nèi)ROS含量降低，GSH升高。此外，添加GSH后發(fā)現(xiàn)在受精32h時(shí)，GGT的mRNA表達(dá)量上升，GCLC和GSS的mRNA表達(dá)水平下降；在受精后18h時(shí)，GGCT的mRNA表達(dá)量下降，5-OPase和GCLM的表達(dá)量上升。與

4、GSH轉(zhuǎn)運(yùn)和再合成相關(guān)的4種酶的活性也發(fā)生了相應(yīng)的改變。其中，在受精后18h，γ-GCS的活性顯著增高（P<0.05），GGCT活性則顯著降低（P<0.05）；在受精后32h，GGT的活性顯著升高（P<0.05），GSS的活性顯著降低（P<0.05）。說明添加GSH能顯著提高體外胚胎發(fā)育能力。
　　采用Illumina平臺(tái)對(duì)8-16細(xì)胞期和桑椹期的牛體外受精胚胎，進(jìn)行測(cè)序；篩選出差異基因進(jìn)行功能注釋和代謝途徑分析；采用定量PCR對(duì)

5、十個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性；在獲得的新轉(zhuǎn)錄本中挑選3組進(jìn)行RNA和蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。在對(duì)OOSP1，THAP9等10個(gè)基因的定量檢測(cè)、測(cè)序結(jié)果的質(zhì)量評(píng)價(jià)（堿基錯(cuò)誤率、Q20、Q30、GC含量）、reads與?；蚪M的比對(duì)及其在基因組的分布統(tǒng)計(jì)分析，均說明該測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。與已知的轉(zhuǎn)錄本相比，4個(gè)新轉(zhuǎn)錄本中均發(fā)現(xiàn)不同長度的新外顯子；預(yù)測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)中除包含各自的保守結(jié)構(gòu)域（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的催化結(jié)構(gòu)域、MAD