間尼索地平對野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓的防治作用及機制研究.pdf

1、肺動脈高壓（PAH）是以肺動脈壓力升高以及血管痙攣、內(nèi)膜增生和重構(gòu)為主要特征的一種疾病。其發(fā)病機制尚未完全明確，目前觀點認為，肺動脈高壓形成的關(guān)鍵在于肺血管收縮和重構(gòu)。肺動脈高壓時，肺血管發(fā)生重構(gòu)主要是由于血管平滑肌細胞增殖凋亡失衡引起的，因此抑制肺血管收縮，改善肺循環(huán)血流動力學(xué)以及阻止肺血管平滑肌細胞異常增殖是治療肺動脈高壓的關(guān)鍵。
　　 鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用，細胞內(nèi)鈣離子濃度（[Ca2+]i

2、）的變化是觸發(fā)細胞增殖相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的始動因素之一。在PAH發(fā)生過程中，5-HT等細胞因子激動相應(yīng)的細胞表面受體后，都要通過胞質(zhì)內(nèi)游離鈣濃度增高這一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用，因此，[Ca2+]i的變化在PAH的形成過程中具有重要作用。
　　 鈣拮抗劑是近年來臨床常用的抗肺動脈高壓藥物，但關(guān)于其逆轉(zhuǎn)肺動脈高壓的確切機制尚不甚明了。間尼索地平（m-Nis）是該校藥學(xué)院合成的二氫吡啶類鈣拮抗劑，前期研究表明其具有良好的穩(wěn)定性以及抑制血管收縮

3、的作用。本實驗以野百合堿（MCT）誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓為模型，觀察m-Nis對肺動脈高壓的防治作用及肺血管重構(gòu)的改善作用。還通過細胞免疫化學(xué)、流式細胞術(shù)、激光共聚焦及細胞分子生物學(xué)等技術(shù)研究m-Nis對5-HT誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細胞增殖、遷移的影響，深入探討其作用機制。
　　 第一部分m-Nis對野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓的防治作用
　　 目的：研究m-Nis對野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓的防治作用及其作用機制。

4、>　　 方法：大鼠單劑量皮下注射MCT（60mg/kg）制備肺動脈高壓模型。導(dǎo)管法測定肺血流動力學(xué)指標。光鏡觀察肺小動脈結(jié)構(gòu)的改變。按試劑盒步驟測定血清中MDA含量及SOD活性。免疫印跡法測定PCNA、ERK1/2和p-ERK1/2的表達水平。免疫組化法觀察5-HT和PCNA的表達。
　　 結(jié)論：m-Nis能明顯降低肺動脈高壓大鼠的平均肺動脈壓，改善右室肥厚程度及肺小動脈構(gòu)型改變，對野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓有一定的防治作用

5、，可能與其抗氧化作用，降低5-HT的表達及抑制ERK1/2MAPK信號通路有關(guān)。
　　 第二部分m-Nis對5-HT誘導(dǎo)大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖、遷移及細胞內(nèi)游離鈣濃度變化的影響
　　 目的：研究m-Nis對5-HT誘導(dǎo)大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖、遷移及細胞內(nèi)游離鈣濃度變化的影響
　　 方法：組織塊種植法原代培養(yǎng)大鼠PASMCs。MTT法測定PASMCs增殖。Transwell遷移小室（8μm孔徑）測定PASMCs

6、的遷移能力。流式細胞儀測定細胞周期。免疫細胞化學(xué)染色及western blot法測定PCNA蛋白表達。激光共聚焦顯微鏡檢測平滑肌細胞內(nèi)Ca2+的變化。定磷法測定CaN活性。western blot法測定ERK1/2及JNK.的磷酸化水平。RT-PCR法檢測c-fos、c-jun、CaM及CaN mRNA的表達。
　　 結(jié)論：（1）m-Nis對5-HT誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細胞增殖和遷移有明顯的抑制作用，可能與其抑制增殖細胞核抗原（P

7、CNA）表達及細胞周期進程有關(guān)。（2）m-Nis明顯抑制了5-HT引起的[Ca2+]i的升高、CaM和CaNmRNA的表達以及CaN活性的升高；對5-HT誘導(dǎo)的ERK1/2，JNK磷酸化水平也有不同程度的抑制，還明顯抑制了增殖相關(guān)基因c-fos，c-junmRNA的表達水平。由此，我們推測m-Nis抗5-HT誘導(dǎo)的PASMCs增殖作用可能還與抑制細胞內(nèi)[Ca2+]i的增高從而阻斷了5-HT所介導(dǎo)的ERK1/2，JNK MAPK信號通路有

8、關(guān)。
　　 第三部分 RhoA/Rho激酶信號通路在5-HT刺激PASMCs增殖中的作用及m-Nis對此信號通路的影響
　　 目的：研究RhoA/Rho激酶信號通路在5-HT刺激PASMCs增殖中的作用及m-Nis對此信號通路的抑制作用。
　　 方法：組織塊種植法原代培養(yǎng)大鼠PASMCs。MTT法測定PASMCs增殖。流式細胞儀測定細胞周期。western blot法測定PCNA蛋白表達及ERK1/2、JNK、M

9、YPT1磷酸化水平。RT-PCR法檢測RhoA、ROCK1、c-fos及c-jun mRNA的表達。
　　 結(jié)論：（1）5-HT明顯誘導(dǎo)了大鼠PASMCs中Rho激酶的表達及激活；Rho激酶抑制劑法舒地爾對5-HT誘導(dǎo)的PASMCs的增殖，細胞周期進展有明顯的抑制作用，還不同程度地抑制了JNK的磷酸化，ERK1/2的核轉(zhuǎn)位以及增殖相關(guān)基因c-fos、c-jun mRNA的表達。說明RhoA/ROCK通路在5-HT誘導(dǎo)的PASMC

10、s增殖中起著重要作用。（2）m-Nis不同程度地抑制了5-HT誘導(dǎo)的RhoA，ROCK1 mRNA的表達以及Rho激酶的活化標志p-MYPT1的蛋白表達。說明m-Nis抗5-HT誘導(dǎo)的PASMCs的增殖作用可能與抑制RhoA/ROCK信號通路有關(guān)。
　　 第四部分活性氧在5-HT刺激PASMCs增殖中的作用及m-Nis對此通路的影響
　　 目的：研究活性氧（ROS）在5-HT刺激PASMCs增殖中的作用和m-Nis對RO

11、S的產(chǎn)生及其下游信號通路的影響。
　　 方法：組織塊種植法原代培養(yǎng)大鼠PASMCs。激光共聚焦檢測ROS生成量的變化。TAB法測定MDA含量。黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。MTT法測定PASMCs增殖。western blot法測定PCNA蛋白表達及ERK1/2、JNK磷酸化水平。
　　 結(jié)論：（1）5-HT明顯誘導(dǎo)了大鼠PASMCs中ROS的生成，H2O2不僅誘導(dǎo)了PASMCs增殖，還提高了ERK1/2及JNK的磷酸化

12、水平。說明ROS在5-HT誘導(dǎo)的PASMCs增殖中起重要作用。（2）m-Nis不僅抑制了ROS的生成，還明顯降低了H2O2誘導(dǎo)的PASMCs增殖及ERK1/2、JNK的磷酸化水平。說明m-Nis抗5-HT誘導(dǎo)的PASMCs增殖作用不僅與其抑制ROS的產(chǎn)生有關(guān)，還與其抑制ROS所介導(dǎo)的ERK1/2，JNK MAPK信號通路有關(guān)。
　　 總結(jié):
　　 1.m-Nis對野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓有一定的防治作用，可能與其抗氧

13、化作用，降低5-HT的表達及抑制ERK1/2 MAPK信號通路有關(guān)。
　　 2.m-Nis對5-HT誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細胞增殖和遷移有明顯的抑制作用，可能與其抑制細胞內(nèi)[Ca2+]i的增高從而阻斷了5-HT所介導(dǎo)的ERK1/2，JNK MAPK信號通路有關(guān)。
　　 3.Rho激酶抑制劑法舒地爾明顯抑制了5-HT誘導(dǎo)的PASMCs增殖，說明RhoA/ROCK通路在5-HT誘導(dǎo)的PASMCs增殖中起重要作用。
　　

14、4.m-Nis不同程度地抑制了5-HT誘導(dǎo)的RhoA，ROCK1 mRNA的表達以及Rho激酶的活化標志p-MYPT1的蛋白表達。說明m-Nis抗5-HT誘導(dǎo)的PASMCs的增殖作用可能與抑制RhoA/ROCK信號通路有關(guān)。
　　 5.ROS在5-HT誘導(dǎo)的PASMCs增殖中起重要作用。m-Nis抗5-HT誘導(dǎo)的PASMCs增殖作用不僅與其抑制ROS的產(chǎn)生有關(guān)，還與其抑制ROS所介導(dǎo)的ERK1/2，JNK MAPK信號通路有關(guān)。