新型納米系統(tǒng)的構(gòu)建及其對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡作用的研究.pdf

1、低氧肺動(dòng)脈高壓(Hypoxicpulmonaryarterialhypertension,HPAH)是臨床肺部疾病包括慢性阻塞性肺病、肺心病的重要病理生理基礎(chǔ),其防治具有重要臨床意義。肺動(dòng)脈高壓(Pulmonaryarterialhypertension,PAH)以肺血管重構(gòu)(Pulmonaryvascularremodeling,PVR)為特征,涉及導(dǎo)致肺小動(dòng)脈的缺失和內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞過(guò)度增生[1],其中肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Pulmon

2、aryarterialsmoothmusclecells,PASMCs)異常增殖是PVR的關(guān)鍵。因此,研究特定病理環(huán)境下阻止及逆轉(zhuǎn)PASMCs異常增殖的機(jī)制,是闡明PAH發(fā)病機(jī)制及防治的關(guān)鍵。
　　近年來(lái),基因治療越來(lái)越受到人們的關(guān)注?；蛑委熓侵笇⑷说恼；蚧蛴兄委熥饔玫幕?通過(guò)一定的方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞,以糾正基因缺陷或者發(fā)揮治療作用,從而達(dá)到治療疾病的目的。目前主要的基因治療方式是通過(guò)向機(jī)體轉(zhuǎn)入小干擾RNA(smallin

3、terferingRNA,siRNA)或反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASON)進(jìn)行靶向基因治療。但是如何使它們?cè)诎麅?nèi)安全及有效的轉(zhuǎn)運(yùn),并且在體內(nèi)穩(wěn)定釋放是目前面臨的難題之一。隨著納米技術(shù)的發(fā)展,利用納米系統(tǒng)作為載體能夠很好地解決ASON、siRNA在胞內(nèi)被核酸酶降解的問(wèn)題,并可促進(jìn)細(xì)胞攝取。本研究的意義在于合成一種由PH-響應(yīng)性醛化的環(huán)糊精(α-cyclodextrin,αCD)和低分子量的聚乙烯亞胺

4、PEI1800NPs組成的新型混合型納米系統(tǒng)Ac-αCDNPs,并由其包裹Bcl-xlASON/mTORsiRNA,探討其安全性及有效性,并分析其對(duì)常氧或低氧條件下大鼠PASMCs增殖和凋亡的影響,從而為PAH、PVR等疾病的防治提供新的理論依據(jù)和策略。
　　目的:
　　構(gòu)建新型納米系統(tǒng)Ac-αCDNPs并包裹Bcl-xlASON/mTORsiRNA,探討其安全性及有效性,以及對(duì)大鼠PASMCs增殖和凋亡的影響。
　　

5、方法:
　　1.新型混合型納米系統(tǒng)Ac-αCDNPs包裹ASON/siRNA的制備及其特性
　?、挪捎酶牧嫉碾p重納米乳化法制造Ac-αCDNPs包裹Bcl-xlASON/mTORsiRNA;
　　⑵采用掃描電鏡、透射電鏡和動(dòng)態(tài)光散射觀察制備納米粒子的形態(tài)及粒徑分布,通過(guò)體外釋放實(shí)驗(yàn)研究納米粒在緩沖液中的水解作用;
　　2.納米系統(tǒng)Ac-αCDNPs包裹Bcl-xlASON對(duì)常氧下RPASMCs增殖和凋亡作用的研究

6、
　　體外培養(yǎng)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(ratpulmonaryarterialsmoothmusclecells,RPASMCs),由納米系統(tǒng)Ac-αCDNPs包裹Bcl-xlASON轉(zhuǎn)染RPASMCs常氧處理48h;應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察RPASMCs對(duì)Ac-αCDNPs包裹Bcl-xlASON的攝取情況;RT-PCR、Westernblot檢測(cè)RPASMCsBcl-xlmRNA和蛋白表達(dá);MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后RPASMCs的增殖

7、;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后RPASMCs的凋亡。
　　3.納米系統(tǒng)Ac-αCDNPs包裹mTORsiRNA對(duì)低氧下RPASMCs增殖和凋亡作用的研究
　　體外培養(yǎng)RPASMCs,分別由Ac-αCDNPs、PLGANPs、PEI1800NPs、PEI25000NPs、Lipofectamine2k攜帶mTORsiRNA轉(zhuǎn)染RPASMCs;MTT法檢測(cè)不同載體對(duì)RPASMCs毒性的影響;激光共聚焦顯微鏡觀察RPASMCs對(duì)Ac-αC

8、DNPs包裹不同濃度mTORsiRNA的攝取情況;對(duì)比觀察RPASMCs對(duì)不同載體攜帶同一濃度mTORsiRNA的攝取情況;流式細(xì)胞術(shù)分析不同載體攜帶mTORsiRNA轉(zhuǎn)染RPASMCs的效率;MTT檢測(cè)不同載體攜帶mTORsiRNA轉(zhuǎn)染RPASMCs后,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用;RT-PCR、Westernblot、3H-TdR、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)不同載體攜帶的mTORsiRNA轉(zhuǎn)染RPASMCs,低氧處理48h后,mTORmRNA和p-m

9、TOR的表達(dá)以及對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響;
　　結(jié)果:
　　1.合成了新型混合型pH-響應(yīng)性醛化的環(huán)糊精納米系統(tǒng)Ac-αCDNPs,具有良好的細(xì)胞相容性;通過(guò)掃描電鏡、透射電鏡和動(dòng)態(tài)光散射顯示,納米粒子按配方制備出界限清楚、粒徑分布均勻的球形,混合的NPs釋放ASON在pH5.0的PBS緩沖液中更容易水解。
　　2.激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)ASON-NPs組細(xì)胞漿內(nèi)含大量呈顆粒狀分布的紅色熒光物質(zhì),Control組和NPs

10、組細(xì)胞胞漿內(nèi)未見(jiàn)紅色熒光物質(zhì);ASON-NPs組Bcl-xlmRNA和蛋白表達(dá)顯著低于Control組和NPs組(P<0.05);ASON-NPs組、NPs組、Control組細(xì)胞抑制率分別為:53.61±3.02％、6.30±1.90%、1.40±0.62%;凋亡率分別為:53.04±2.09%、10.98±2.03%、2.19±0.11%,ASON-NPs組細(xì)胞凋亡率顯著高于Control組和NPs組(P<0.01)。
　　3

11、.Ac-αCDNPs、PLGANPs、PEI1800NPs、PEI25000NPs、Lipofectamine2k處理RPASMCs后,在同一濃度下,Ac-αCDNPs對(duì)細(xì)胞的毒性最小;Ac-αCDNPs包裹mTORsiRNA轉(zhuǎn)染RPASMCs,隨著mTORsiRNA濃度的增加,RPASMCs內(nèi)紅色熒光的表達(dá)強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng),50、100、200pmol/mL組較25pmol/mL組熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P<0.05)。半定量及定量分析顯示,

12、Ac-αCDNPs組較PEI1800NPs、PEI25000NPs、Lipofectamine2k組轉(zhuǎn)染效率顯著提高(P<0.05)。Ac-αCDNPs、PLGANPs、PEI1800NPs、PEI25000NPs、Lipofectamine2k攜帶mTORsiRNA對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為:49.26±2.22%、42.9±2.24%、35.79±1.52%、34.76±1.68%、30.66±1.55%。Ac-αCDNPs包裹mTO

13、RsiRNA對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯高于其他載體組(P<0.05)。低氧處理RPASMCs24h、48h、96h后,mTORmRNA和p-mTOR表達(dá)在24h開(kāi)始升高(P<0.05),48h達(dá)最高峰(P<0.01);低氧處理RPASMCs12h、24h、48h、96h后,48h、96h組細(xì)胞增殖率顯著高于24h組(P<0.05)。Ac-αCDNPs、PLGANPs、PEI1800NPs、PEI25000NPs、Lipofectamine2

14、k攜帶mTORsiRNA轉(zhuǎn)染RPASMCs低氧處理48h后,Ac-αCDNPs組RPASMCsmTORmRNA和p-mTOR表達(dá)水平顯著低于其他載體組(P<0.05)。不同載體攜帶mTORsiRNA轉(zhuǎn)染RPASMCs低氧處理48h后,Ac-αCDNPs組細(xì)胞的凋亡率顯著高于其他載體組,而增殖率顯著低于其他載體組(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了包裹Bcl-xlASON/mTORsiRNA的混合型納米系統(tǒng)Ac-