乙型肝炎病毒X基因相關(guān)肝細(xì)胞癌變的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，居我國癌癥死亡的第三位。大約有80％的HCC與乙肝病毒(HeptitisBVirus，HBV)感染有關(guān)，其致病機(jī)理比較復(fù)雜，危害嚴(yán)重。HBV基因組包含4個(gè)開放閱讀框，包括S、C、P和X區(qū)，分別編碼相應(yīng)的抗原蛋白。HBx是HBV基因組所編碼蛋白質(zhì)中唯一具有多種調(diào)控功能的病毒蛋白質(zhì)，可反式激活一些細(xì)胞的原癌基因及病毒的基因，HBx通過多種方式

2、直接或間接地對病毒自身的復(fù)制與增殖以及宿主細(xì)胞中基因的表達(dá)與調(diào)控、細(xì)胞的凋亡與癌變等過程產(chǎn)生廣泛的影響。HBx的這種現(xiàn)象與機(jī)制在近些年成為研究的熱點(diǎn)，逐漸闡明HBx與宿主蛋白質(zhì)廣泛地相互作用，但HBx誘發(fā)肝細(xì)胞癌的具體機(jī)制仍不完全清楚。本研究利用二維差異凝膠電泳技術(shù)(Two-dimensionalDifferentialIn-gelElectrophoresis，DIGE)，以期通過比較相關(guān)肝細(xì)胞在轉(zhuǎn)染HBx前后細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異

3、，找到HBx與HCC密切相關(guān)的差異蛋白。 為了進(jìn)行乙型肝炎病毒(HBV)X基因相關(guān)肝細(xì)胞癌變的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，我們構(gòu)建了HBx相關(guān)的肝細(xì)胞模型。首先參考GenBank核苷酸序列庫中的HBV核苷酸序列設(shè)計(jì)合成了一對用于HBx基因擴(kuò)增的引物，以質(zhì)粒V5為模板，擴(kuò)增兩端分別包含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的X基因序列。然后將EGFP載體及X基因的PCR產(chǎn)物雙酶切后用T4連接酶將兩者連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMl09，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒命

4、名為EGFP-HBx。將重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞Changliver及HepG2，激光共聚焦顯微鏡下檢測其轉(zhuǎn)染效率，并挑選已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，在G418的作用下篩選穩(wěn)定株細(xì)胞，使用RT-PCR和WesternBlotting檢測HBx的表達(dá)情況，進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)分析HBx轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞Changliver后細(xì)胞周期發(fā)生的變化。雙酶切結(jié)果和序列分析表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。激光共聚焦顯微鏡下觀察到HBx轉(zhuǎn)染到HepG2的效率要比Cha

5、ngliver高，RT-PCR和WesternBlotting結(jié)果都能證實(shí)HBx在細(xì)胞Changliver及HepG2已表達(dá)，而且流式細(xì)胞術(shù)分析表明HBx蛋白加快了細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)一步證實(shí)HBx能促進(jìn)細(xì)胞的增殖。 利用二維差異凝膠電泳技術(shù)DIGE技術(shù)研究肝癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的差異時(shí)應(yīng)先對其蛋白樣品進(jìn)行標(biāo)記系統(tǒng)評(píng)估，以確保正式實(shí)驗(yàn)的成功。我們對提取樣品進(jìn)行了2DE的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示其重復(fù)性都能達(dá)到90％以上。然后將提取的細(xì)胞蛋白

6、經(jīng)DIGETM試劑盒的3重?zé)晒?Cy2、Cy3、Cy5)標(biāo)記后再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和雙向電泳(2DE，Two-dimensionalElectrophoresis)。SDS-PAGE掃描后的圖像使用ImageQuant軟件進(jìn)行分析，結(jié)果說明肝癌細(xì)胞蛋白提取液與該染料能相互兼容，樣品得到了有效的標(biāo)記，且蛋白量與熒光強(qiáng)度之間有較好的線性關(guān)系。2DE的掃描圖像使用DeCyder5.0軟件的DIA(Differentia

7、lIn-gelAnalysis)和BVA(BiologicalVariationAnalysis)模式分析，結(jié)果說明Cy3和Cy5標(biāo)記的蛋白質(zhì)定量結(jié)果基本一致，但該染料標(biāo)記肝癌細(xì)胞蛋白后會(huì)造成極少量蛋白如低分子量蛋白和極酸性極堿性蛋白出現(xiàn)位置偏差，給蛋白定量帶來一定的誤差，而BVA中的反標(biāo)策略能夠有效糾正這種由于不同熒光標(biāo)記帶來的定量誤差。總之，我們對整個(gè)DIGE實(shí)驗(yàn)流程都進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，標(biāo)記實(shí)驗(yàn)和標(biāo)記評(píng)價(jià)都獲得了較好的結(jié)果，達(dá)到了滿意

8、的定量效果，提示該蛋白完全可以進(jìn)行正式2D-DIGE實(shí)驗(yàn)。我們首次報(bào)道了用同一肝癌樣品進(jìn)行不同熒光標(biāo)記后進(jìn)行2DE的評(píng)估方法，該方法支持了DIGE體系定量的可靠性，而且能給出定量的誤差范圍，更進(jìn)一步地完善了DIGE技術(shù)的評(píng)估體系，為DIGE技術(shù)平臺(tái)的質(zhì)量控制提供了很好的參考。 在肝癌細(xì)胞蛋白樣品的2D-DIGE技術(shù)體系成熟之后，我們利用該技術(shù)結(jié)合生物質(zhì)譜MALDI-TOF-TOF/MSMS比較了HBx基因在轉(zhuǎn)染相應(yīng)肝細(xì)胞系Cha

9、ngliver和HepG2細(xì)胞前后的差異，及HBV整合進(jìn)細(xì)胞HepG2后的變化，并對部份蛋白進(jìn)行了鑒定，以期探索HBX造成細(xì)胞癌變的機(jī)理。在p＜0.05、|ration|＞2時(shí)我們在以上三個(gè)比較組里分別找到了25、30、159個(gè)差異蛋白。統(tǒng)計(jì)分析后可以提出具體差異蛋白的蛋白點(diǎn)號(hào)，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)在Changliver_HBX的差異點(diǎn)有8個(gè)可以在HBV組中找到，而HepG2_HBX組的差異點(diǎn)只有2個(gè)能在HBV組找到，這兩個(gè)細(xì)胞系組別里只有1個(gè)共