HBV X蛋白抑制阿霉素誘導的肝癌細胞凋亡及可能機制.pdf

1、研究背景: 全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染者已超過3.5億人，并呈上升趨勢，主要分布在亞洲和非洲，每年大約有一百萬人死于HBV相關的肝臟腫瘤。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，占癌癥死亡率第二位，嚴重威脅著人們的健康。HBV感染是引起肝癌的主要原因之一，流行病學調查表明，HBV感染者發(fā)生HCC的幾率較正常人高100倍，但HBV致

2、癌的具體機制尚不明確。 乙型肝炎病毒X基因編碼的X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是一種多功能病毒調節(jié)蛋白，具有廣泛的基因轉錄調控作用，并能與宿主細胞的多種蛋白質相互作用，從而調節(jié)基因表達與細胞蛋白質功能，進而影響病毒自身的復制、宿主細胞的信號轉導、細胞增殖與分化、細胞凋亡等重要過程，HBx的這些功能可能在HBV相關性HCC的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但其發(fā)揮作用的確切機制目前尚不清楚，有待于

3、進一步研究闡明。 細胞凋亡(apoptosis)是由特定基因調控的程序性死亡，對維持機體的自身穩(wěn)定性和防止惡性腫瘤的發(fā)生是十分重要的。細胞凋亡的紊亂與多種疾病與腫瘤包括HCC的發(fā)生密切相關。阿霉素(adriamycin，Adr)是一種臨床上常用的抗腫瘤藥物，它的主要作用機制是誘導腫瘤細胞DNA損傷和干擾DNA代謝，從而促進腫瘤細胞凋亡。阿霉素誘導腫瘤細胞凋亡的過程可能是通過p53-PTEN通路發(fā)揮作用的。 研究目的:

4、 以阿霉素誘導HepG<,2>細胞凋亡作為模型，研究HBx對肝癌細胞凋亡的調控作用及其可能機制，進而為闡明HBx在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)。 實驗方法: 以adr亞型HBV質粒pHBV DNA為模板，采用PCR法擴增HBV X基因片段，并定向插入綠色熒光蛋白真核表達載體pEGFP．C1的HindIII和Kpn I酶切位點，并用HindⅢ、Kpn Ⅰ雙酶切及測序鑒定以構建重組體pGFP/HBx。采用脂質體轉染

5、法將GFP真核表達載體pEGFP-C1、重組體pGFP-HBx轉染HepG<,2>細胞，轉染后36小時傳細胞，用G418篩選出抗性細胞克隆，逐級擴大培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察GFP-HBx融合蛋白表達，采用RT-PCR檢測HBV X基因轉錄、表達，以建立穩(wěn)定表達細胞系HepG<,2>/GFP、HepG<,2>/GFP-HBx細胞。采用阿霉素(2.0ug/ml)分別處理HepG<,2>、HepG<,2>/GFP、HepG<,2>/GFP-H

6、Bx細胞，阿霉素處理后不同時間在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化、臺盼蘭染色計數(shù)死亡細胞。阿霉素處理后36小時，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，并采用RT-PCR檢測p53、PTEN的轉錄表達，采用western blot檢測p53、PTEN蛋白的表達。 實驗結果: 經雙酶切及測序鑒定成功構建了GFP與HBV X重組表達載體pGFP-HBx；將pEGFP-C1、pGFP-HBx重組體轉染HepG<,2>，經G418篩選獲得抗性

7、細胞克隆；在熒光顯微鏡下見部分抗性克隆細胞表達較強的GFP熒光蛋白。將帶綠色熒光的抗性克隆細胞擴大培養(yǎng)并經傳70代，細胞仍表達強的熒光蛋白，RT-PCR檢測表明轉染重組體GFP-HBx的HepG<,2>/GFP-HBx細胞有HBV X基因轉錄、表達。在HepG<,2>、HepG<,2>/GFP細胞，阿霉素誘導了明顯的凋亡性細胞死亡，表現(xiàn)為細胞變圓、脫落，而在HepG<,2>/GFP-HBx細胞，未見明顯細胞死亡;流式細胞儀分析阿霉素處理

8、后36小時HepG<,2>、HepG<,2>/GFP、HepG<,2>/GFP-HBx細胞的凋亡率分別為59.03﹪，61.38﹪，4.21﹪。阿霉素處理后36小時，RT-PCR和western blot分析發(fā)現(xiàn)，與HepG<,2>、HepG<,2>/GFP細胞相比，HepG<,2>/GFP-HBx細胞的PTEN的轉錄和蛋白表達降低，而p53的轉錄和蛋白表達水平無明顯變化。 結論: 1、成功構建了GFP-HBV X基因的