珍珠層人工骨骨誘導(dǎo)作用及相關(guān)機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，珍珠層(nacre)作為一種新型骨生物替代材料受到了更多的關(guān)注。珍珠層來源于海洋中軟體動(dòng)物雙殼類珍珠貝科或蚌科動(dòng)物的貝殼內(nèi)層，其組成成分主要為文石型碳酸鈣，并含有少量有機(jī)質(zhì)和微量金屬元素。我們前期研究表明：珍珠層人工骨能夠促進(jìn)兔橈骨長(zhǎng)節(jié)段骨缺損的修復(fù)：在犬腰椎橫突間骨融合及兔顱骨缺損的修復(fù)實(shí)驗(yàn)中均觀察到明顯的成骨作用。珍珠層人工骨具有低免疫原性、良好的生物相容性、可降解性、骨傳導(dǎo)性和較好的成骨作用。珍珠層作為生物骨替代材料，與其

2、他無機(jī)生物材料相比，其優(yōu)勢(shì)在于含有具有誘導(dǎo)成骨作用的功能成分。基于此，本研究從珍珠層中提取水溶性物質(zhì)，通過細(xì)胞學(xué)及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討其對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow derived stromal cells，BMSCs)向成骨細(xì)胞方向分化的作用及相關(guān)機(jī)制，并研究珍珠層水溶性提取物(water soluble matrix of nacre powder，WSM)與血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growt

3、h factor BB，PDGF-BB)協(xié)同作用下的骨誘導(dǎo)作用，旨在探討珍珠層人工骨骨誘導(dǎo)作用及相關(guān)機(jī)制。同時(shí)開展珍珠層人工骨與人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的相容性研究，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。 目的： 1．探討WSM誘導(dǎo)人BMSCs成骨性分化的作用及機(jī)制，以及PDGF-BB在此過程中的協(xié)同作用。 2．建立成骨細(xì)胞-骨髓基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)體系，探討共育體系中兩種細(xì)胞的生物學(xué)特性及WSM對(duì)于復(fù)合培養(yǎng)體系生物學(xué)行為的影響。

4、 3．觀察WSM誘導(dǎo)的大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞與珍珠層人工骨復(fù)合后在大鼠肌袋內(nèi)的異位成骨作用，進(jìn)一步明確珍珠層人工骨的骨誘導(dǎo)作用。 4．研究珍珠層人工骨與入骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生物相容性。 方法： 1．體外分離培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(hBMSCs)，利用形態(tài)學(xué)、測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、HE染色、Giemsa染色及流式細(xì)胞術(shù)等方法對(duì)hBMSCs進(jìn)行鑒定。 2．低溫狀態(tài)下提取珍珠層粉(馬氏珍珠貝)中的水溶性物質(zhì)(WSM)，利用真

5、空冷凍干燥技術(shù)將其濃縮。不同濃度作用于hBMSCs，檢測(cè)堿性磷酸酶活性，制定劑量．效應(yīng)曲線，確定最佳作用濃度。 3．WSM及PDGF-BB作用于體外培養(yǎng)的第3代的hBMSCs，以地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)基為陽性對(duì)照，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WSM對(duì)hBMSCs細(xì)胞周期的影響。誘導(dǎo)后的不同時(shí)間點(diǎn)，分別采用Gormori法堿性磷酸酶(AKP)染色、茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色等方法評(píng)價(jià)WSM、PDGF-BB誘導(dǎo)hBMSCs成骨性分化的效能；同時(shí)采用One-

6、step RT-PCR方法檢測(cè)hBMSCs誘導(dǎo)前后骨形成蛋白(BMP-2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-B1)、核心結(jié)核因子(Cbfa-1)等生長(zhǎng)因子表達(dá)差異。 4．原代分離hBMSCs和人成骨細(xì)胞(OBs)，將2種細(xì)胞置于Transwell共育環(huán)境中共同培養(yǎng)，建立hBMSCs-OBs共育體系。分別采用MTT、丫啶橙染色、AKP活性檢測(cè)等方法初步評(píng)價(jià)共育體系中兩種細(xì)胞增殖、凋亡及功能改變情況。WSM作用于共育體系，不同時(shí)間點(diǎn)利用One

7、-step RT-PCR方法檢測(cè)共育體系中hBMSCs細(xì)胞BMP-2、AKP、TGF-β1、Cbfa-1、Osteoncction、Osteocalcin、Osteopontin等成骨標(biāo)志基因表達(dá)情況，判斷WSM對(duì)共育體系中hBMSCs成骨性分化的誘導(dǎo)作用。 5．分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(rBMSCs)，將rBMSCs種植于珍珠層人工骨材料上，利用WSM體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，植入3月齡SD大鼠背部肌袋內(nèi)，分別以復(fù)合未誘導(dǎo)rBM

8、SCs、單純珍珠層人工骨材料作對(duì)照。于植入后1d、4、8和12周時(shí)行X線攝片，觀察WSM誘導(dǎo)的rBMSCs-人工骨材料復(fù)合物在大鼠體內(nèi)異位成骨情況。在4、8和12周取材，經(jīng)大體觀察、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)異位成骨情況。 6．將hBMSCs與珍珠層人工骨材料及WSM共同培養(yǎng)，用倒置顯微鏡、考馬斯亮藍(lán)染色法、四唑鹽(MTT)比色法、掃描電鏡等方法，研究珍珠層人工骨與hBMSCs生物相容性。 結(jié)果： 1．hB

9、MSCs細(xì)胞剛貼壁時(shí)呈三角形、圓形、紡綞形或多角形等不規(guī)則形狀。傳代后形成單層時(shí)呈典型的漩渦式生長(zhǎng)。生長(zhǎng)曲線呈“S”形。hBMSCs表達(dá)CD29、CD44、和CDl05為陽性，而CD45、CD34表達(dá)為陰性。 2．WSM初提液經(jīng)真空冷凍干燥方法濃縮至30mg/ml，不同濃度作用于hBMSCs。結(jié)果表明100μg/ml以下的WSM對(duì)hBMSCs的AKP活性影響不大，當(dāng)達(dá)到15μg/ml時(shí)作用效果最顯著，之后再增加濃度作用無明顯增加

10、，因此確定15μg/ml的WSM為本研究的實(shí)驗(yàn)濃度。 3．hBMSCs誘導(dǎo)后第3d及第7d，WSM組、PDGF-BB+WSM及誘導(dǎo)培養(yǎng)基組的AKP染色均為陽性，第7d時(shí)更為明顯；而空白對(duì)照組及PDGF-BB組則僅見極少數(shù)的AKP染色弱陽性細(xì)胞，未見典型的AKP陽性細(xì)胞。hBMSCs誘導(dǎo)后第18天，誘導(dǎo)培養(yǎng)基組茜素紅染色可見典型同心圓狀的紅色鈣化結(jié)節(jié)；WSM組形成不成熟的鈣化結(jié)節(jié)，較為典型；PDGF-BB+WSM組形成的鈣化結(jié)節(jié)數(shù)

11、量較多，體積??；空白對(duì)照組及PDGF-BB組未見明顯鈣化結(jié)節(jié)形成。 4．骨髓基質(zhì)細(xì)胞．成骨細(xì)胞共育體系能夠促進(jìn)OBs的增殖與AKP的活性，同時(shí)抑制BMSCs的凋亡，促進(jìn)BMSCs的趨化聚集。培養(yǎng)第7天，共育體系能夠提高h(yuǎn)BMSCs的BMP-2、AKP、Cbfa-1、TGF-β1基因的表達(dá)(P<0.05)；WSM能夠使共育體系中hBMSCs的BMP-2、AKP表達(dá)進(jìn)一步提高(P<0.05)；而WSM對(duì)Cbfa-1、TGF-β1、C

12、ollage-1、Osteonectin等基因表達(dá)無影響(P>0.05)。 5．復(fù)合WSM誘導(dǎo)后rBMSCs的人工骨植入大鼠肌袋內(nèi)發(fā)生異位成骨：8周時(shí)有類骨質(zhì)形成，12周時(shí)材料中出現(xiàn)較為成熟的板層樣骨組織，其中可見小梁骨；復(fù)合rBMSCs的對(duì)照組12周僅有少量不規(guī)則小梁骨形成；單純材料組僅見纖維結(jié)締組織及肌肉組織長(zhǎng)入材料，未見成骨發(fā)生。X線檢查，組內(nèi)比較，WSM+rBMSCs+人工骨組12周時(shí)材料的X線阻射密度值與4周時(shí)相比有統(tǒng)

13、計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其余兩組各時(shí)間點(diǎn)無差異。組間比較，WSM+rBMSCs+人工骨組12周時(shí)阻射密度值高于其他兩組，余未見差異(P>0.05)。 6．MTT法顯示隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，珍珠層人工骨材料對(duì)hBMSCs生長(zhǎng)與增殖無影響(各時(shí)間點(diǎn)P>0.05)。掃描電鏡顯示hBMSCs可在珍珠層人工骨材料表面良好生長(zhǎng)，增殖并分泌基質(zhì)，WSM能夠促進(jìn)hBMSCs總蛋白表達(dá)。 結(jié)論： 1．WSM能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的hBMS

14、Cs的成骨性分化，PDGF-BB在此過程中具有協(xié)同效應(yīng)，而PDGF-BB單獨(dú)作用時(shí)無骨誘導(dǎo)作用。 2．BMSCs-OBs共育體系能夠促進(jìn)OBs的增殖及堿性磷酸酶的表達(dá)，降低hBMSCs的凋亡，促進(jìn)hBMSCs的趨化聚集，提高h(yuǎn)BMSCs的BMP-2、TGF-β1等因子的表達(dá)。 3．WSM能夠促進(jìn)BMSCs-OBs共育體系內(nèi)OBs分化，提高h(yuǎn)BMSCs的BMP-2、AKP等基因表達(dá)。WSM對(duì)OBs的成熟及BMSCs的成骨性