蕨麻多酚對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：本課題研究蕨麻多酚對(duì)缺氧損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 方法：
　　 1.人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(EA.hy926)的培養(yǎng)：按常規(guī)方法復(fù)蘇后接種于40ml培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO2，飽和濕度條件下，使用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(含青霉素1×105U/L，鏈霉素100mg/L)培養(yǎng)。至細(xì)胞生長(zhǎng)成單層，進(jìn)行3次傳代后用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2.通過(guò)MTT法，LDH（

2、乳酸脫氫酶）活性檢測(cè)與臺(tái)盼藍(lán)染色法確定適宜的缺氧時(shí)間，建立細(xì)胞缺氧損傷模型。
　　 3.將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的內(nèi)皮細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，缺氧損傷模型組，蕨麻多酚高、中、低劑量組(2.4mg/ml、1.2mg/ml、0.6mg/ml)和復(fù)方丹參陽(yáng)性藥物組（DSP滴丸組，2.4mg/ml）（缺氧同時(shí)加入相應(yīng)藥物）。通過(guò)MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞代謝活力，比色法檢測(cè)細(xì)胞外LDH活性。
　　 4.通過(guò)H.E染色法觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化。

3、
　　 5.用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性，用硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量。
　　 6.檢測(cè)各組細(xì)胞外總一氧化氮合酶(NOS)活性，NO含量和內(nèi)皮素-1(ET-1)含量。
　　 7.應(yīng)用RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)檢測(cè)各組HIF-1α、eNOS、iNOS及ET-1 mRNA的表達(dá)水平。
　　 8.應(yīng)用Western Blot（免

4、疫印跡）技術(shù)檢測(cè)各組HIF-1α、eNOS蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.在倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，正常培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好，呈圓形、長(zhǎng)梭形或多角形緊密貼壁，鵝卵石狀鑲嵌鋪滿底層，折光性強(qiáng)，分裂相多。
　　 2.蕨麻多酚對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用：(1)MTT實(shí)驗(yàn)：缺氧損傷模型組細(xì)胞與正常對(duì)照組相比，其代謝活力下降(P＜0.01)；蕨麻多酚各劑量組、DSP滴丸組細(xì)胞與缺氧損傷模型組相比，其代謝活

5、力均明顯提高(P＜0.01)。(2)H．E染色：缺氧損傷細(xì)胞間隙增大，聯(lián)系減少，細(xì)胞核被深染，蕨麻多酚干預(yù)后，細(xì)胞損傷減輕。(3)LDH活性檢測(cè)：缺氧損傷模型組與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞外LDH活性明顯升高(P＜0.01)；蕨麻多酚各劑量組、DSP滴丸組與缺氧損傷模型組相比，細(xì)胞外LDH活性均明顯降低(P＜0.01)。
　　 3.蕨麻多酚對(duì)缺氧損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制研究：(1)生化指標(biāo)檢測(cè)：缺氧損傷模型組與正常對(duì)照組相比，

6、細(xì)胞內(nèi)SOD活性下降(P＜0.01)；蕨麻多酚各劑量組、DSP滴丸組與模型組相比，細(xì)胞內(nèi)SOD活性(高、低劑量組P＜0.01，中劑量組P＜0.05)顯著升高。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)MDA含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；缺氧損傷模型組與正常對(duì)照組相比，總NOS活性增加(P＜0.01)，NO含量增加(P＜0.01)，ET-1含量增加（P＜0.01）；蕨麻多酚各劑量組、DSP滴丸組與缺氧損傷模型組比較，NO含量均顯著減少(P＜0.01)，NOS活性

7、(P＜0.01)和ET-1含量均降低（P＜0.01）。(2)RT-PCR:缺氧損傷模型組與正常對(duì)照組相比，HIF-1αmRNA、iNOS mRNA、ET-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），而eNOS mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)。蕨麻多酚各劑量組、DSP滴丸組與缺氧模型組相比，HIF-1αmRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)；蕨麻多酚高、中劑量組、DSP滴丸組的eNOS mRNA表達(dá)水平升高(P＜0.01)；

8、蕨麻多酚高劑量組的iNOS mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.01）；蕨麻多酚高、中劑量組、DSP滴丸組的ET-1 mRNA表達(dá)水平降低(P＜0.01)。(4)Western Blot:缺氧損傷模型組與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，HIF-1α蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），eNOS蛋白表達(dá)降低(P＜0.01)。蕨麻多酚各劑量組和DSP滴丸組與缺氧損傷模型組相比，HIF-1α蛋白表達(dá)降低（高劑量組P＜0.05;中、低劑量組，DSP滴丸組P＜0.01），