弓形蟲表面抗原P30與免疫佐劑CTA2-B復合基因在畢赤酵母中的分泌表達、純化與鑒定.pdf

1、弓形蟲是一種專性細胞內(nèi)寄生的原蟲，能感染包括人類在內(nèi)的所有哺乳動物，引起人獸共患弓形蟲病。弓形蟲呈世界性分布，人群感染率高達25％～50％。孕婦孕期首次感染，弓形蟲可穿越胎盤屏障感染胎兒，影響其發(fā)育，重者導致畸胎、死胎，存活者也常有畸形及智力發(fā)育不全等嚴重后遺癥，同時可使孕婦出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)。健康成人感染弓形蟲多為隱性感染，但當機體免疫功能受累時，如患惡性腫瘤、艾滋病或器官移植等，弓形蟲的增殖力和致病力明顯增強，是其致死的重要原因。弓形蟲

2、還可引起禽畜疾病，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。迄今為止，無任何有效的防治方法。疫苗的研究成為預防與治療弓形蟲病的發(fā)展方向。 P30抗原作為弓形蟲速殖子表面的主要抗原之一，具有較強的免疫原性，能夠誘導機體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA抗體和CD8+T細胞殺傷弓形蟲，是最有希望的疫苗候選抗原。另外，弓形蟲病主要通過粘膜途徑感染，應用無毒性的霍亂毒素A2/B(CTA2/B)亞基作為免疫佐劑，能有效增強P30蛋白的免疫原性，可以增強免疫

3、作用，打破免疫耐受，是研制高效的弓形蟲疫苗的理想佐劑。 國內(nèi)外學者曾用多種表達系統(tǒng)來表達P30與CTA2/B蛋白，動物和人體實驗結(jié)果顯示疫苗的效果不理想。原核表達系統(tǒng)操作簡單、產(chǎn)量高，但缺乏真核生物的基因表達調(diào)控機制和蛋白質(zhì)的加工修飾能力，表達產(chǎn)物往往沒有生物活性，質(zhì)量不高。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)雖能正確表達蛋白，但產(chǎn)量低，無法進行P30蛋白下游研究和大規(guī)模動物實驗。本研究選用既具有原核生物的優(yōu)點，又具有真核生物功能的畢赤酵母表達

4、系統(tǒng)。迄今為止，畢赤酵母表達系統(tǒng)已成功地表達了400多種蛋白。酵母是單細胞真核生物，兼有細菌易培養(yǎng)、遺傳操作簡單、高效表達外源蛋白等優(yōu)點，又具有真核細胞的糖基化和二硫鍵形成等加工和修飾作用，是表達外源蛋白的適宜宿主。本研究使用的酵母表達載體pGAPZαA是組成型表達載體，含有引導蛋白出胞的α-信號肽，可使產(chǎn)物分泌出胞，有利于產(chǎn)品的純化和生產(chǎn)；利用編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因的啟動子，可組成性表達外源基因而不需要甲醇誘導；

5、攜帶c-myc表位和多組氨酸尾，具有Zeocin抗性篩選標記基因；強效可調(diào)控啟動子AOXl，能高密度發(fā)酵，外源蛋白表達水平很高，如破傷風毒索蛋白的產(chǎn)量達12g/L。 本研究采用分子生物學的方法，擬構(gòu)建含有弓形蟲主要表面抗原P30與免疫佐劑CTA2/B復合基因的克隆載體及酵母表達載體，并在畢赤酵母中表達、純化與鑒定。方法：PCR擴增復合基因，TA克隆建立克隆載體pMD18T-p30-CTX；用亞克隆技術(shù)把P30-CTX復合基因克隆

6、入表達載體，構(gòu)建酵母表達載體pGAPZαA-p30-CTX；重組載體分別以PCR、酶切及測序鑒定；使用生物信息軟件分析P30-CTX復合基因，預測編碼蛋白結(jié)構(gòu)。線性化重組酵母表達載體，電穿孔法導入畢赤酵母GS115，抗生素Zeocin篩選、PCR法鑒定陽性轉(zhuǎn)化子；酵母工程菌搖瓶表達，取上清液進行SDS-PAGE和Westernblotting分析。結(jié)果：成功構(gòu)建了含目的基因的克隆載體pMD18T-p30-CTX和酵母表達載體pGAP-p

7、30-CTX。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切鑒定正確，測序結(jié)果證實為pGAP-p30-CTX基因，序列分析同源性為99.82％，生物信息學預測P30-CTX蛋白結(jié)構(gòu)折疊無明顯改變。P30-CTA2/B重組蛋白在畢赤酵菌中成功分泌表達，產(chǎn)量高達0.57g/L；SDS-PAGE顯示其在49000處有一條明顯表達蛋白條帶，WesternBlot結(jié)果顯示表達蛋白具有P30抗原特異性，并測定蛋白純度、濃度和產(chǎn)量。結(jié)論意義：大量具有免疫活性的P30-CTA