MDSC在MHV-3誘導(dǎo)小鼠暴發(fā)性肝衰竭中的作用及作用機(jī)制.pdf

1、【研究背景及目的】
　　乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV)感染在發(fā)展中國(guó)家和亞太地區(qū)的流行情況非常嚴(yán)重,我國(guó)亦是HBV感染高發(fā)地區(qū),人群攜帶率約10％,由HBV引起的暴發(fā)性肝衰竭(fulminanthepaticfailure,FHF)和慢加急性肝衰竭(acute-on-chronicliverfailure,ACLF),其病情兇險(xiǎn),死亡率高達(dá)70%以上,臨床上缺乏特異而有效的治療靶點(diǎn)和干預(yù)手段,除非實(shí)施肝移植

2、,絕大部分患者預(yù)后不良。病毒誘導(dǎo)的肝衰竭的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,近年來我們對(duì)Ⅲ型鼠肝炎病毒(murinehepatitisvirusstrain3,MHV-3)誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)型肝衰竭和HBV誘導(dǎo)的慢加急性肝衰竭(HBV-inducedacute-on-chronicliverfailure,HBV-ACLF)進(jìn)行研究中證實(shí),NK細(xì)胞與肝衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。肝臟中含有豐富的NK細(xì)胞,其作為機(jī)體天然免疫的第一道防線發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。此外

3、NK細(xì)胞還具有調(diào)節(jié)肝臟損傷,募集外周血淋巴細(xì)胞等功能。近期研究證實(shí),在小鼠肝炎模型、感染HBV以及HCV的患者體內(nèi),NK細(xì)胞均能介導(dǎo)肝損傷。在MHV-3誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型以及小鼠巨細(xì)胞(MCMV)模型中,NK細(xì)胞可以大量殺傷被病毒感染的肝臟細(xì)胞。Balb/cJ小鼠感染MHV-3后,NK細(xì)胞在肝臟迅速大量募集和活化,且殺傷活性顯著增強(qiáng),分泌IFN-γ和TNF-α的水平也顯著上調(diào),而且可通過Fas-FasL和NKG2D-NKG2DL

4、途徑損傷肝細(xì)胞,表明肝臟NK細(xì)胞在MHV-3誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝衰竭中可能發(fā)揮重要作用。但是,在天然免疫階段,機(jī)體如何調(diào)劑NK細(xì)胞,特別是如何抑制NK細(xì)胞的活性的免疫學(xué)機(jī)制尚不清楚。
　　髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)是一種骨髓細(xì)胞,具有高度的異質(zhì)性。并且由于其最初發(fā)現(xiàn)時(shí)具有免疫抑制性,因此而得名。在病理?xiàng)l件下,如癌癥、急性和慢性感染、創(chuàng)傷、創(chuàng)傷后應(yīng)激、移植、糖尿病、以及一些自身免疫性疾病等條件下,MDSCs可以大量增殖,并且迅速進(jìn)入

5、外周血,并最終募集于相應(yīng)的靶器官以及組織中。小鼠MDSC細(xì)胞可以用CD11b+Gr-1+作為標(biāo)示。已有研究證實(shí),該群細(xì)胞可以抑制T細(xì)胞的增殖,抑制T細(xì)胞的活化。但是并不是所有的MDSCs細(xì)胞均表現(xiàn)為免疫抑制性,已有研究證實(shí)在肝臟疾病模型中,LY6C+MDSCs可以激活NK細(xì)胞表達(dá)活化性受體NKG2D。表達(dá)CD11b+Gr-1+的細(xì)胞也并不完全等價(jià)于MDSCs,他還包括成熟的中性粒細(xì)胞,炎癥單核細(xì)胞,腫瘤壞死因子以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶介導(dǎo)

6、的DC細(xì)胞(Tip-DC)。現(xiàn)有研究證實(shí),部分MDSCs不是簡(jiǎn)單的被激活的炎性單核細(xì)胞或者中性粒細(xì)胞的前體,而是具有強(qiáng)大免疫抑制性的特殊免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞。MDSCs在適應(yīng)性免疫階段對(duì)T細(xì)胞活性的抑制已經(jīng)得到了廣泛的實(shí)驗(yàn)論證。其主要的機(jī)制為依賴精氨酸酶-1,環(huán)氧化酶-2,前列腺素E2,NO(一氧化氮),活性氧(ROS)的上調(diào)介導(dǎo)對(duì)T細(xì)胞活性的抑制。另外,可以通過產(chǎn)生生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子-β(TGF-β)以及耗竭半胱氨酸,調(diào)節(jié)T細(xì)胞表面L型受體的表達(dá)

7、等途徑抑制T細(xì)胞的活性。
　　另外,有研究證實(shí),在天然免疫階段,MDSCs可以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的免疫學(xué)活性。在荷瘤小鼠模型中,MDSCs可以抑制NK細(xì)胞分泌能夠殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子。除此以外,MDSC細(xì)胞可以抑制NK細(xì)胞分泌IFN-γ,以此達(dá)到抑制NK細(xì)胞活性的目的。而上述免疫抑制功能,均需依靠細(xì)胞-細(xì)胞相互接觸完成。另外有研究表明,表達(dá)CD11b+Gr-1+F4/80+的MDSCs可以抑制NKT細(xì)胞的活性,另外可以通過表達(dá)RAE-

8、1(維甲酸早期誘導(dǎo)因子-1),激活NK細(xì)胞。
　　已有文獻(xiàn)很少有提及在病毒感染狀態(tài)下,MDSCs對(duì)NK細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)以及其相應(yīng)的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)、體外兩方面闡述在MHV-3誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型中,MDSCs中LY6G+細(xì)胞亞群對(duì)NK細(xì)胞活性的抑制作用以及作用機(jī)制。另外對(duì)MDSCs的另一亞群LY6Gneg細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的活化作用做了簡(jiǎn)單的探討。并且對(duì)于ICAM-1與CD11b之間的相互作用導(dǎo)致NK細(xì)胞以及MDSCs在肝臟中的

9、募集機(jī)制做了一定的研究。
　　具體研究目標(biāo)如下:
　　1.建立小鼠暴發(fā)性肝炎模型
　?、僭诩膊∵M(jìn)程中動(dòng)態(tài)觀察小鼠骨髓,外周血,肝臟,脾臟內(nèi)MDSCs的分布。
　?、谘芯扛闻KMDSCs的分群
　?、垩芯縈DSCsLY6Ghi亞群對(duì)NK細(xì)胞的免疫抑制性作用。
　?、苎芯縈DSCsLY6neg亞群對(duì)NK細(xì)胞的活化作用。
　　2.探討NK細(xì)胞以及MDSCs在肝臟中的募集機(jī)制動(dòng)態(tài)觀察肝臟細(xì)胞ICAM-1的

10、表達(dá)以及NK細(xì)胞、MDSC細(xì)胞CD11b的表達(dá)。
　　【研究方法】
　　1.采用MHV-3腹腔途徑感染Balb/cJ小鼠建立暴發(fā)性肝衰竭模型。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MHV-3感染0、24、48、72h后的Balb/cJ小鼠肝臟、脾臟、外周血和骨髓中MDSCs的相對(duì)數(shù)量(MDSC/MNC)。
　　3.多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染MHV-3前后,肝臟中MDSCs的分群,以及其分群特點(diǎn)。
　　4.體外共培養(yǎng)條件下MD

11、SCsLY6Ghi亞群對(duì)NK細(xì)胞的抑制性作用。檢測(cè)NK細(xì)胞共培養(yǎng)后NKG2D(MFI)的表達(dá),INF-γ的分泌以及對(duì)YAC-1細(xì)胞的殺傷能力。通過抗體阻斷的方式,研究LY6GhiMDSCs對(duì)NK細(xì)胞的抑制性機(jī)制。
　　5.用細(xì)胞過繼實(shí)驗(yàn)以及抗體阻斷實(shí)驗(yàn),觀察在體內(nèi)環(huán)境下MDSCs對(duì)NK細(xì)胞活性的影響,以及觀察小鼠的生存曲線。
　　6.在體外共培養(yǎng)的條件下MDSCsLY6Ghi亞群對(duì)NK細(xì)胞的活化性作用。檢測(cè)NK細(xì)胞共培養(yǎng)后N

12、KG2D(MFI)的表達(dá),INF-γ的分泌以及對(duì)YAC-1細(xì)胞的殺傷能力。檢測(cè)LY6GhiMDSCsRAE-1的表達(dá)。
　　7.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染MHV-3前后(48h)小鼠肝臟細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)情況。檢測(cè)NK細(xì)胞以及MDSCsCD11b的表達(dá)情況。
　　8.在體內(nèi)環(huán)境下,用抗體阻斷的方法阻斷ICAM-1,觀察小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型的生存曲線,以及感染病毒48h肝臟病理變化。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
　　1.在正常小

13、鼠肝臟內(nèi),MDSCs分為2個(gè)亞群即:Ly6ChiLy6GnegMDSCs亞群以及Ly6CintLy6GnegMDSCs亞群。在感染MHV-348小時(shí),小鼠肝臟MDSCs明顯分為3個(gè)亞群:Ly6ChiLy6GnegMDSCs亞群,Ly6CintLy6GnegMDSCs亞群,Ly6CintLY6GhiMDSCs亞群.Ly6CintLy6GhiMDSCs具有SSChi(較高的側(cè)向散射)這一特性,并且具有環(huán)狀核即分葉核。Ly6CintLy6Gn

14、egMDSCs具有SSCint特性,Ly6ChiLy6GnegMDSCs具有SSClow特性。這兩亞群細(xì)胞更具有淋巴細(xì)胞不分葉核這一特性。
　　2.在感染MHV-3病毒48小時(shí)后,小鼠外周血、脾臟、骨髓的單個(gè)核細(xì)胞中MDSCs的比例發(fā)生變化,即表達(dá)CD11b+Gr-1+細(xì)胞相對(duì)數(shù)量發(fā)生變化。在外周血中,由30.7%上升至45.7%。在脾臟中,由16.5%下降至9.7%。在骨髓中,由63.7%下降至38.4%。
　　3.在體外

15、條件下將取自正常小鼠肝臟的NK細(xì)胞與感染48小時(shí)MHV--3小鼠肝臟的LY6GhiMDSCs共培養(yǎng)12小時(shí),NK細(xì)胞表達(dá)NKG2D(MFI)降低,分泌IFN-γ減少,對(duì)YAC-1細(xì)胞的殺傷作用均降低。用Transwell,抗體阻斷方法,證實(shí),LY6GhiMDSCs對(duì)NK細(xì)胞的抑制性作用是通過非細(xì)胞-細(xì)胞接觸式,并且依賴TGF-β以及NO途徑。
　　4.在體內(nèi)用Gr-1抗體阻斷,以及LY6GhiMDSCs過繼方法證實(shí)。正常小鼠過繼L

16、Y6GhiMDSCs后,小鼠肝臟NK細(xì)胞表達(dá)NKG2D(MFI)下降。且過繼LY6GhiMDSCs,抗體阻斷Gr-1均可以延長(zhǎng)小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型小鼠的生存時(shí)間。
　　5.在體外條件下將取自正常小鼠肝臟的NK細(xì)胞與感染48小時(shí)MHV-3小鼠肝臟LY6c細(xì)胞共培養(yǎng)12小時(shí)。NK細(xì)胞表達(dá)NKG2D(MFI)上升。且流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè),小鼠感染MHV-3,48小時(shí)后,LY6Cint-hiLY6GnegMDSCs表達(dá)RAE-1上升。
　

17、　6.流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)感染MHV-348h后,小鼠肝臟細(xì)胞ICAM-1(MFI)上升。小鼠肝臟NK細(xì)胞,LY6GhiMDSC細(xì)胞表達(dá)CD11b(MFI)上升。抗體阻斷小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型小鼠ICAM-1,小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)。
　　【結(jié)論】
　　1、本研究首次利用MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝衰竭小鼠模型探討了肝臟MDSCs在病毒誘導(dǎo)的肝衰竭中作用。著重探討了MDSC細(xì)胞亞群LY6GhiMDSCs對(duì)NK細(xì)胞的免疫學(xué)抑制作用。
　　

18、2、本研究首次在MHV-3誘導(dǎo)小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型中,感染小鼠肝臟內(nèi)MDSCs的分群以及細(xì)胞動(dòng)力學(xué)改變。
　　3、研究發(fā)現(xiàn),Balb/cJ小鼠感染MHV-3后,MDSCs在肝臟迅速大量募集。其中LY6GhiMDSCs亞群,可以通過TGF-β以及NO途徑抑制NK細(xì)胞表達(dá)NKG2D以及分泌IFN-γ,抑制NK細(xì)胞的殺傷作用。另外LY6Cint-hiLY6GnegMDSCs可以通過RAE-1途徑,激活NK細(xì)胞表達(dá)NKG2D(MFI)。上